長鏈非編碼RNA整體實驗

1、提供長鏈非編碼RNA（LncRNA）整體實驗方案：客戶根據(jù)課題標書及需做實驗的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項目方案，含課題申請書，實驗方案，實驗設計，實驗思路，實驗文獻等與實驗相關等內(nèi)容和資料。或者由嘉美實驗協(xié)助實驗委托者完成長鏈非編碼RNA（LncRNA）整體實驗方案的設計。

2、項目評估報價：公司技術團隊根據(jù)客戶提供的相關資料，綜合評估項目可行性，與客戶共同確定準確的實驗項目執(zhí)行方案，給出準確的實驗價格。嘉美實驗協(xié)助設計的課題直接給出準確的報價。

3、簽訂服務協(xié)議：簽署服務協(xié)議并預付部分費用，做好實驗初步準備及項目預安排。

4、執(zhí)行服務項目：正式啟動實驗進程，全面展開實驗，確保項目有效執(zhí)行。

5、溝通項目進展：及時溝通反饋實驗的Newest進展，隨時了解掌控實驗的Newest動態(tài)。

6、完成項目交付：支付剩余尾款，交付實驗結(jié)果，正確應用實驗結(jié)果，提供售后服務。

一、非編碼RNA（Non-coding RNA）介紹
1、非編碼RNA（Non-coding RNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 、microRNA 和lncRNA等多種已知功能的 RNA，還包括未知功能的RNA。目前主要研究方向集中在非編碼RNA 及其相互結(jié)合的DNA、RNA、蛋白質(zhì)等科學問題，而科學問題的解答依賴于實驗技術的創(chuàng)新使用和革命。
2、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度＞200bp的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，lncRNA具有保守的二級結(jié)構(gòu),大部分不編碼蛋白質(zhì)。LncRNA發(fā)揮功能的方式很廣，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調(diào)控。主要包括基因組表觀遺傳修飾、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯、發(fā)揮ceRNA、增強子RNA作用等，從而對細胞的增殖、分化、遷移、凋亡、免疫等發(fā)揮調(diào)控作用。

3、LncRNA火熱的十年。近年來，LncRNA相關研究在國內(nèi)外的熱度居高不下，早在1991年，Xist 調(diào)控X染色體的失活就登上Nature，但當時認為這只是一種特殊情況。2007年Howard Chang在Cell上發(fā)表題為“Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs”的論文，正式開啟了LncRNA火熱的十年。

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二、LncRNA詳解
下面從以下5個方面來介紹LncRNA：LncRNA的定義、LncRNA的發(fā)現(xiàn)、LncRNA的分類、LncRNA的功能以及LncRNA的作用模式
1、LncRNA的定義
LncRNA(Long non-coding RNA)，是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，一些LncRNAs，長度超過90kb，也被稱為macroRNA，如 Airn 和 KCNQ1OT1。標準“非編碼”是指在轉(zhuǎn)錄本中缺少開放閱讀框 和/或 保守密碼子，2011年 Cell發(fā)表論文表明LncRNA可以被核糖體吸引，其中一些能翻譯產(chǎn)生小肽。 編碼肽的能力與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物充當功能性RNA的能力并不一定沖突， 事實上，越來越多的證據(jù)表明雙功能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物既可以作為蛋白質(zhì)模板，也可以作為LncRNAs。

Cell論文證實LncRNA能翻譯產(chǎn)生小肽

2、LncRNA的發(fā)現(xiàn)
LncRNA起初被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學功能 。然而，1991年，Nature等雜志刊文證實 Xist參與X染色體失活的調(diào)控（圖4）。此后越來越多的研究表明，LncRNA在眾多生命活動過程中發(fā)揮重要作用，LncRNA開始引起人們廣泛的關注。再加上二代測序技術的發(fā)展，大量 LncRNA 被發(fā)現(xiàn)。
 

發(fā)現(xiàn)Xist參與X染色體失活

3、LncRNA的分類
  1）正義LncRNA，與編碼基因的一個或多個外顯子重疊；
  2）反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與相反鏈上的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物部分或*互補；
  3）內(nèi)含子LncRNA，由基因的內(nèi)含子產(chǎn)生；
  4）雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，與蛋白質(zhì)編碼基因共享相同的啟動子，但轉(zhuǎn)錄方向相反；
  5）基因間LncRNAs（LincRNA），由位于蛋白質(zhì)編碼基因之間的序列獨立轉(zhuǎn)錄；
  6）增強子RNA（eRNA），由蛋白質(zhì)編碼基因的增強子區(qū)域產(chǎn)生；
  7）circRNA，由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物剪接并形成共價閉合的環(huán)狀RNA。
注：該處將circRNA歸類于LncRNA

4、LncRNA的功能
LncRNA 在劑量補償效應、表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，也與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病息息相關，也正因此成為生命科學領域的研究熱點。
RNA不僅僅是承擔遺傳信息中間載體的輔助性角色，而是更多地承擔了各種調(diào)控功能。LncRNA發(fā)揮功能主要依靠其二級結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)結(jié)合，可引起染色質(zhì)重構(gòu)、影響轉(zhuǎn)錄因子功能等。另外，還可以在其線性水平與miRNA結(jié)合，間接影響mRNA表達，也可以直接與mRNA結(jié)合，影響mRNA翻譯、剪切、降解過程。LncRNA在發(fā)育和基因表達中發(fā)揮的復雜精確的調(diào)控功能*地解釋了基因組復雜性之難題，同時也為人們從基因表達調(diào)控網(wǎng)絡的維度來認識生命體的復雜性開啟新的天地。但是目前對LncRNA的認知可以說還處在初級階段，前路漫漫，還有許多需要探索。

5、LncRNA的作用模式
LncRNA 的作用模式主要分為四大類: signal、decoy、guide、scaffold。
  1）signal-信號
  LncRNA的*種作用是調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。已有的研究發(fā)現(xiàn)，不同的刺激條件和信號通路下，LncRNA將會被特異性地轉(zhuǎn)錄，并作為信號傳導分子參與特殊信號通路的傳導。一些LncRNA分子被轉(zhuǎn)錄后，擁有調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的作用。從生物體的角度而言，利用RNA進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控是具有明顯優(yōu)勢的，因為利用RNA進行調(diào)控，由于不涉及蛋白質(zhì)的翻譯，因此具有更好的反應速度，對于機體的某些急性反應可以做出更好更迅速的相應。
  2）decoy-誘餌
  LncRNA的第二種作用是分子阻斷劑。這一類LncRNA被轉(zhuǎn)錄后，它會直接和蛋白（與這類LncRNA相互作用的蛋白都是轉(zhuǎn)移因子/轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子）結(jié)合，從而阻斷了該分子的作用和信號通路。由于LncRNA的結(jié)合，這類轉(zhuǎn)錄因子的功能被阻斷，從而調(diào)控下游的基因轉(zhuǎn)錄。
  3）guide-引導
  第三種作用模式是LncRNA與蛋白結(jié)合（通常是轉(zhuǎn)錄因子），然后將蛋白復合物定位到特定的DNA序列上。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA介導的這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用可以是順式作用模式，也可以是反式作用機制，因此僅僅從LncRNA的序列上是無法獲得信息的。
  4）scaffold-支架
  LncRNA 還可以起到一個“中心平臺”的作用，即多個相關的轉(zhuǎn)錄因子都可以結(jié)合在這個LncRNA分子上。在細胞機體中，當多條信號通路同時被激活，這些下游的效應分子可以結(jié)合到同一條LncRNA分子上，實現(xiàn)不同信號通路之間的信息交匯和整合，有利于機體/細胞迅速地對外界信號和刺激產(chǎn)生反饋和調(diào)節(jié)。

三、LncRNA的研究思路
LncRNA的相關研究逐漸成為了當今生物醫(yī)學較熱門的研究領域之一。近幾年有關LncRNA研究的國自然立項數(shù)連年增長，2016年261項，2017年更是達到了345項，在這里講一下LncRNA研究中經(jīng)典的ABCD模式——A基因通過B基因/信號通路在C疾病中發(fā)揮D功能。
先看一下以下這四篇影響因子5分左右的LncRNA研究的文章的題目。
 

以上4篇5分左右的LncRNA研究文章，從題目來看，都符合A基因通過B基因/信號通路在C疾病中發(fā)揮D功能的模式。
 

【嘉美實驗課題實驗分析】以長征醫(yī)院李兵教授和陳萬生教授作為通訊作者發(fā)表在《Cancer Letter》的 LncRNA-UCA1 exerts oncogenic functions in non-small cell lung cancer by targeting miR-193a-3p為例，來講一下LncRNA研究中典型的ABCD模式。首先我們看一下該文章的題目：LncRNA-UCA1（A基因）通過靶向miR-193a-3p（B基因）在非小細胞肺癌（C疾?。?/strong>中發(fā)揮致癌作用（D功能）?？梢哉f是*符合ABCD模式。

  1）確定研究對象C疾病——非小細胞肺癌
  本文的研究對象是肺癌，肺癌是較常見的癌癥之一，并且是*癌癥相關死亡率的主要原因。非小細胞肺癌在診斷的肺癌病例中占大多數(shù)。

  2）確定研究A基因——LncRNA-UCA1
  LncRNA-UCA1是人類尿路上皮癌相關的LncRNA, 初在人類膀胱癌中被鑒定，調(diào)節(jié)和發(fā)揮致癌功能。2014年，Li.等人報道UCA1通過mTOR-STAT3/microRNA143通路促進糖酵解，引發(fā)UCA1可能作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），介導與靶標miRNA結(jié)合來發(fā)揮致癌作用的猜想，這一猜想隨后在肝癌中被證實。
   （1）本文作者首先在112對非小細胞肺癌組織和5種人類非小細胞肺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)UCA1的表達增高，并且UCA1的高表達與預后不良有關，如下圖：

  （2）隨后進行體外實驗驗證，做了較常用的過表達和干擾的實驗，在A549 和 H1299非小細胞肺癌細胞系中過表達和敲低UCA1，發(fā)現(xiàn)UCA1促進細胞增殖和克隆形成（如下圖）。說明異常表達的UCA1與非小細胞肺癌的惡性程度的確有關，但是UCA1通過什么機制來發(fā)揮其致癌活性仍是未知。

   3）LncRNA-UCA1的分子機制——通過B基因發(fā)揮D功能

   （1）近有報道稱UCA1參與腫瘤的發(fā)展是通過作為特定miRNA的ceRNA來實現(xiàn)的。因此作者猜測UCA1在非小細胞肺癌中也是通過類似機制發(fā)揮致癌活性。作者首先通過在線microRNA-target程序 預測了miRNA的靶定位點，找出了10個常見的UCA1相關結(jié)合位點的miRNAs。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達UCA1后，miR-135a, miR-18a, miR-143, 和miR-193a-3p的表達水平顯著降低。通過免疫共沉淀實驗（CHIP）發(fā)現(xiàn)，在RNA誘導沉默復合體（RISC）核心元件Ago2中檢測到了miR-135a, miR-18a, miR-143, miR-193a-3p 以及 UCA1，但是miR-193a-3p被富集的多。為了進一步確認，作者構(gòu)建了UCA1-wt或者UCA1-Mut(突變掉miR-193a-3p結(jié)合位點)的報告基因載體，發(fā)現(xiàn)UCA1-Mut不再抑制miR-193a-3p，再次證明了miR-193a-3p是一個UCA1-targeting的miRNA。隨后作者在相同的112對非小細胞肺癌組織中隨機挑取32對檢測了miR-193a-3p的表達，發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p表達水平明顯較低，并與UCA1的表達水平呈負相關（如下圖）。

（2）緊接著作者發(fā)現(xiàn)在A549 和H1299細胞中過表達miR-193a-3p減弱了UCA1對細胞增殖的促進作用（如下圖），說明UCA1促進腫瘤細胞的生長某種程度上依賴于競爭性地結(jié)合miR-193a-3p。

（3）已知在非小細胞肺癌中，miR-193a-3p通過下調(diào)ERBB4發(fā)揮腫瘤抑制的作用。作者發(fā)現(xiàn)，過表達UCA1-wt顯著增加了ERBB4的蛋白水平，過表達UCA1-Mut對ERBB4的蛋白水平無影響，然而敲低UCA1顯著降低了ERBB4的蛋白水平，并均不影響ERBB4的mRNA水平（如下圖）。

 UCA1通過競爭性海綿作用結(jié)合miR-193a-3p，解除了miR-193a-3p對ERBB4的抑制，進而發(fā)揮了其致癌的功能。到這里，A基因通過B基因/信號通路在C疾病中發(fā)揮D功能的模式就講完了。

參考文獻：
1、Rinn John L,et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.[J] .Cell, 2007, 129(7): 1311-23.
2、Ingolia Nicholas T,et al.Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.[J] .Cell, 2011, 147(4): 789-802.
3、Beermann Julia,et al. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.[J] .Physiol. Rev., 2016, 96(4): 1297-325.
4、Borsani G, et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome[J]. Nature, 1991, 351(6324):325.