信號(hào)通路整體實(shí)驗(yàn)

1、提供各類信號(hào)通路整體實(shí)驗(yàn)方案：客戶根據(jù)課題標(biāo)書及需做實(shí)驗(yàn)的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項(xiàng)目方案，含課題申請(qǐng)書，實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)思路，實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等與實(shí)驗(yàn)相關(guān)等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹?shí)驗(yàn)協(xié)助實(shí)驗(yàn)委托者完成各類信號(hào)通路整體實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。

2、項(xiàng)目評(píng)估報(bào)價(jià)：公司技術(shù)團(tuán)隊(duì)根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評(píng)估項(xiàng)目可行性，與客戶共同確定準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)價(jià)格。嘉美實(shí)驗(yàn)協(xié)助設(shè)計(jì)的課題直接給出準(zhǔn)確的報(bào)價(jià)。

3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費(fèi)用，做好實(shí)驗(yàn)初步準(zhǔn)備及項(xiàng)目預(yù)安排。

4、執(zhí)行服務(wù)項(xiàng)目：正式啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，全面展開實(shí)驗(yàn)，確保項(xiàng)目有效執(zhí)行。

5、溝通項(xiàng)目進(jìn)展：及時(shí)溝通反饋實(shí)驗(yàn)的Newest進(jìn)展，隨時(shí)了解掌控實(shí)驗(yàn)的Newest動(dòng)態(tài)。

6、完成項(xiàng)目交付：支付剩余尾款，交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正確應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供售后服務(wù)。

一、信號(hào)通路整體實(shí)驗(yàn)介紹
1、信號(hào)通路簡(jiǎn)單介紹：是指能將細(xì)胞外的分子信號(hào)經(jīng)細(xì)胞膜傳入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的一系列酶促反應(yīng)通路。這些細(xì)胞外的分子信號(hào)（稱為配體，ligand）包括激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)以及其它小分子化合物等。細(xì)胞內(nèi)各種不同的生化反應(yīng)途徑都是由一系列不同的蛋白組成的，執(zhí)行著不同的生理生化功能。各個(gè)信號(hào)通路中上游蛋白對(duì)下游蛋白活性的調(diào)節(jié)（包括激活或抑制作用）主要是通過添加或去除磷酸基團(tuán)，從而改變下游蛋白的立體構(gòu)象完成的。所以，構(gòu)成信號(hào)通路的主要成員是蛋白激酶和磷酸酶，它們能夠快速改變和恢復(fù)下游蛋白的構(gòu)象。從細(xì)胞受體接收外界信號(hào)到后做出綜合性應(yīng)答，不僅是一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，更重要的是將外界信號(hào)進(jìn)行逐步放大的過程。受體蛋白將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)信號(hào)，經(jīng)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大、分散和調(diào)節(jié)，終產(chǎn)生一系列綜合性的細(xì)胞應(yīng)答，包括下游基因表達(dá)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)酶活性的變化、細(xì)胞骨架構(gòu)型和DNA合成的改變等。這些變化并非都是由一種信號(hào)引起的，也可以通過幾種信號(hào)的不同組合產(chǎn)生不同的反應(yīng)。

2、常見的信號(hào)通路：
  1）JAK-STAT信號(hào)通路
JAK-STAT信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程。與其它信號(hào)通路相比，這條信號(hào)通路的傳遞過程相對(duì)簡(jiǎn)單，它主要由三個(gè)成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT。許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子通過JAK-STAT信號(hào)通路來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)，這包括白介素27（IL-27）、GM-CSF（粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子）、GH（生長(zhǎng)激素）、EGF（表皮生長(zhǎng)因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干擾素）等等。
  2）p53信號(hào)通路
p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)性高的基因。1979年，Lane和Crawford在感染了SV40的小鼠細(xì)胞內(nèi)分離獲得一個(gè)與SV40大T抗原相互作用的蛋白，因其分子量為53 kDa，故而取名為p53（人的基因稱為TP53）。之后，在基因同源性的基礎(chǔ)上又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了p73和p63，它們也因各自的分子量而得名，具有和p53相似的結(jié)構(gòu)和功能。p53基因受多種信號(hào)因子的調(diào)控。雖然正常狀態(tài)下p53的mRNA水平很高，而且有大量蛋白質(zhì)合成，但p53蛋白容易降解，所以正常細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平很低。p53基因敲除小鼠雖然可以產(chǎn)生后代，但其生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)出現(xiàn)高頻率的自發(fā)性腫瘤，這提示p53蛋白與腫瘤之間存在密切的關(guān)系。
  3）NF-kB信號(hào)通路
NF-κB是屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有五種NF-κB/Rel都具有Rel同源區(qū)，能形成同或異二聚體，啟動(dòng)不同的基因轉(zhuǎn)錄。靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB結(jié)合成三聚體而被隱蔽于細(xì)胞質(zhì)，胞外刺激可激活I(lǐng)κB的泛素化降解途徑，而使NF–κB二聚體進(jìn)入胞核，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
  4）Wnt信號(hào)通路
Wnt是一類分泌型糖蛋白，廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，是一類在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。Wnt信號(hào)在動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關(guān)重要的作用。在小鼠中，腫瘤病毒整合在Wnt之后而導(dǎo)致乳腺癌。卷曲蛋白（Frz）作為Wnt受體，其胞外N端具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域， Frz作用于胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白（Dsh），Dsh能切斷β-catenin的降解途徑，從而使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子（TCF/LEF）相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。
  5）BMP信號(hào)通路
BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白，bone morphogenetic protein）是TGF-β（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，transforming growth factor-β）超家族中的重要成員。它通過調(diào)節(jié)一系列下游基因的活性，控制著諸如中胚層形成、神經(jīng)系統(tǒng)分化、牙齒和骨骼發(fā)育以及癌癥發(fā)生等許多重要的生物學(xué)過程。
  6）Notch信號(hào)通路
Notch基因早發(fā)現(xiàn)于果蠅，部分功能缺失導(dǎo)致翅緣缺刻。在胚胎發(fā)育中，當(dāng)上皮組織的前體細(xì)胞中分化出神經(jīng)元細(xì)胞后，其細(xì)胞表面Notch配體Delta與相鄰細(xì)胞膜上的Notch結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)通路，防止其它細(xì)胞發(fā)生同樣的分化。當(dāng)配體和相鄰細(xì)胞的Notch結(jié)合后，Notch被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號(hào)的胞質(zhì)區(qū)ICN，進(jìn)入細(xì)胞核與CLS結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

二、信號(hào)通路研究三部曲
1、信號(hào)通路家族龐大，種類繁多，成員更是多不勝數(shù)，它們彼此之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，*無(wú)跡可尋。有時(shí)同一個(gè)通路中既有想要研究的，又有不需要研究的，比如P53通路不僅在細(xì)胞周期中展露，還總是在細(xì)胞周期、凋亡、DNA修復(fù)等過程中橫插一腳。有時(shí)某個(gè)信號(hào)通路的家族圖譜一眼望去密密麻麻（如下圖），看的人暈暈乎乎，一臉懵逼，除了感嘆“貴圈真亂”，簡(jiǎn)直不知道如何揭示該家族隱藏的“奧秘”。
 

2、盡管信號(hào)通路中成員眾多，但是大多數(shù)都是跑龍?zhí)祝挥形挥谛盘?hào)中心的核心分子才算得上是真正紅的發(fā)紫的“大腕”。由于它們的一舉一動(dòng)都牽扯整個(gè)家族的命運(yùn)，信號(hào)通路常常會(huì)以它們的名稱命名，比如TGF-β/Smad、Jak/Stat、MAPK/ERK等。此時(shí)，科研者們大可盯緊這些大腕，地毯式調(diào)查其上下游的其他分子，如果能有幸碰到其他“明星分子”，如PTEN、KRAS、FOXO1等，也許你就會(huì)對(duì)大腕與明星分子之間的“愛恨糾葛”有了深入的了解。

3、正所謂人紅粉絲多，有的明星通路追捧者甚多，其間種種八卦早已見于報(bào)端，那么再想對(duì)其進(jìn)入深入挖掘看起來(lái)似乎是一件耗費(fèi)精力且不討好的事情?？墒牵械男』锇榫褪遣凰佬?，就是想以此明星通路博得心儀雜志的青睞，此時(shí)倒是可以另辟蹊徑：去研究某種特定細(xì)胞（細(xì)胞X）類型中的一個(gè)熱點(diǎn)信號(hào)通路的作用。

4、以信號(hào)通路A-B-C為例，研究者在選擇特定細(xì)胞時(shí)，要先了解該細(xì)胞的生理功能及其在某種疾病中所發(fā)揮的重要性；并確定該通路A-B-C在細(xì)胞X中的功能研究仍處于空白狀態(tài)，有一定的研究意義。而后便可按以下研究思路進(jìn)行研究。
   
1）某信號(hào)通路與細(xì)胞X的相關(guān)性。證明通路A-B-C與細(xì)胞X的病理狀態(tài)之間存在相關(guān)性?？赏ㄟ^涵蓋多種通路的手段進(jìn)行中等通量的篩選（如蛋白芯片或PCR芯片），來(lái)確保信號(hào)通路A-B-C參與細(xì)胞X病變的生理過程；以及通過WB、qPCR等實(shí)驗(yàn)確定該通路A-B-C中關(guān)鍵分子的變化，如表達(dá)差異，定位異常、活性變化等。
2）通路中A分子與細(xì)胞X病變間的因果關(guān)系。
以分子A為例，構(gòu)建A在X細(xì)胞中特定敲除的小鼠模型，并檢測(cè)出相應(yīng)的表型，可確定A分子的變化與細(xì)胞X病變之間存在一定的因果關(guān)系；并用挽救實(shí)驗(yàn)（rescue experiment）進(jìn)行驗(yàn)證，即上調(diào)A分子表達(dá)檢測(cè)細(xì)胞X的相應(yīng)表型能否得以恢復(fù)。
3）檢測(cè)通路關(guān)鍵分子間的相互作用方式。以該分子為基礎(chǔ)，通過分子互作實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如IP、GST-Pull down等）、分子定位、活性、構(gòu)象等檢測(cè)手段，來(lái)明確分子間作用的方式（分子A與分子C之間是直接作用，還是通過分子B進(jìn)行間接作用），以及分子A的結(jié)合序列、結(jié)構(gòu)域等。