分子機(jī)制的研究

1、提供各種分子機(jī)制整體實(shí)驗(yàn)方案：客戶(hù)根據(jù)課題標(biāo)書(shū)及需做實(shí)驗(yàn)的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項(xiàng)目方案，含課題申請(qǐng)書(shū)，實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)思路，實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等與實(shí)驗(yàn)相關(guān)等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹?shí)驗(yàn)協(xié)助實(shí)驗(yàn)委托者完成各種分子機(jī)制整體實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。

2、項(xiàng)目評(píng)估報(bào)價(jià)：公司技術(shù)團(tuán)隊(duì)根據(jù)客戶(hù)提供的相關(guān)資料，綜合評(píng)估項(xiàng)目可行性，與客戶(hù)共同確定準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)價(jià)格。嘉美實(shí)驗(yàn)協(xié)助設(shè)計(jì)的課題直接給出準(zhǔn)確的報(bào)價(jià)。

3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費(fèi)用，做好實(shí)驗(yàn)初步準(zhǔn)備及項(xiàng)目預(yù)安排。

4、執(zhí)行服務(wù)項(xiàng)目：正式啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，全面展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，確保項(xiàng)目有效執(zhí)行。

5、溝通項(xiàng)目進(jìn)展：及時(shí)溝通反饋實(shí)驗(yàn)的Newest進(jìn)展，隨時(shí)了解掌控實(shí)驗(yàn)的Newest動(dòng)態(tài)。

6、完成項(xiàng)目交付：支付剩余尾款，交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正確應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供售后服務(wù)。  

一、分子機(jī)制研究介紹
1、分子機(jī)制研究概述
分子機(jī)制是指生物機(jī)體結(jié)構(gòu)組成部分的相互關(guān)系，以及其間發(fā)生的各種變化過(guò)程的物理、化學(xué)性質(zhì)和相互關(guān)系?，F(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)的目的，就是從分子機(jī)制的角度解釋疾病發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程，并從中發(fā)展出相關(guān)的疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、預(yù)防、診斷和治療技術(shù)。通過(guò)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究，可利用分子、細(xì)胞生物學(xué)等研究手段闡明疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，篩選疾病診斷的生物標(biāo)志物，確定疾病治療/干預(yù)的靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)藥物的創(chuàng)制。在臨床上，醫(yī)生可基于分子醫(yī)學(xué)的臨床決策，通過(guò)基因組醫(yī)學(xué)實(shí)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，通過(guò)生物標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)疾病診斷，通過(guò)個(gè)體化醫(yī)療實(shí)現(xiàn)疾病治療。

2、分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)研究領(lǐng)域
  1）疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制
  2）基因、遺傳與疾病的關(guān)系
  3）個(gè)體化治療的分子基礎(chǔ)
  4）治療有效性判斷的分子基礎(chǔ)

3、分子醫(yī)學(xué)發(fā)展方向：
1）從機(jī)理發(fā)現(xiàn)向醫(yī)學(xué)應(yīng)用的轉(zhuǎn)化
 2）新的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

二、嘉美實(shí)驗(yàn)分子機(jī)制研究的五個(gè)經(jīng)驗(yàn)
五個(gè)經(jīng)驗(yàn)分別為：信號(hào)通路; 明星分子; 中心法則; 工具分子; 具體位點(diǎn);
1、信號(hào)通路
信號(hào)通路非常多，找到一條是關(guān)鍵，通路關(guān)系太復(fù)雜，講不清楚影響這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。確定信號(hào)通路的方法有很多，特別是當(dāng)我們已經(jīng)把一個(gè)基因的細(xì)胞和動(dòng)物功能闡述清楚后：
  1）通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道或者已知經(jīng)驗(yàn)，比如分子A的功能是影響細(xì)胞自噬，那么像PI3K-Akt-mTOR通路等就是我們可以直接通過(guò)閱讀綜述獲取的；
  2）通過(guò)RNA-seq或者芯片或者其它組學(xué)手段，篩選差異基因并對(duì)差異基因進(jìn)行pathway或者GSEA富集分析，從而找到可能被基因A調(diào)控的信號(hào)通路；
  3）通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，比如基于與基因A存在共表達(dá)關(guān)系來(lái)分析周?chē)蛩鶇⑴c的通路，從而得到A可能參與的通路，我們可以通過(guò)cbioportal/GEPIA對(duì)TCGA收錄腫瘤中的信息進(jìn)行分析，也可以分析GEO等非腫瘤的共表達(dá)結(jié)果，甚至有一些網(wǎng)站直接收錄了這種共表達(dá)關(guān)系。

2、明星分子
明星分子選得好，文章分?jǐn)?shù)才能高，中游節(jié)點(diǎn)較常選，上下連接左右逢源。明星分子的概念大而且含糊，盡管通路是一個(gè)大的網(wǎng)絡(luò)，但是總體上上下游關(guān)系還是存在的，如果簡(jiǎn)單來(lái)劃分可以分為上游，中游和下游三段，三者之間沒(méi)有嚴(yán)格的界限，一般的通路常常出現(xiàn)分子類(lèi)型有：配體與受體，激酶/磷酸酶（去/泛素化酶）與底物，轉(zhuǎn)錄因子和靶基因等，以TGFβ-Smad通路為例，如果把細(xì)胞膜和核膜作為上中下分類(lèi)的區(qū)分點(diǎn)，可以粗略的這么劃分和標(biāo)注：

那么在這個(gè)通路里面什么分子是明星分子呢？一般來(lái)說(shuō)，大家選的重點(diǎn)集中在中游這個(gè)范圍內(nèi)，下游的分子（比如圖中的p15）一般用來(lái)作為細(xì)胞表型（細(xì)胞周期）的證據(jù)，可能考慮到膜蛋白研究的復(fù)雜和困難性，大家也很少選擇上游的分子，所以中游的分子就成了明星分子選擇的重點(diǎn)了，特別是通路的名字叫做TGFβ-Smad，所以很多研究就是圍繞Smad這個(gè)蛋白展開(kāi)，比如Smad這個(gè)家族的蛋白即是轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)結(jié)合靶基因的DNA調(diào)控分子表達(dá)，其本身又可以被磷酸化發(fā)揮功能，所以又是激酶-底物這一關(guān)系中的底物這一角色，因此激酶-Smad-磷酸化的Smad（轉(zhuǎn)錄因子）-靶基因就成了一個(gè)信號(hào)軸。

  3、中心法則
中心法則像樓梯，三個(gè)水平無(wú)數(shù)級(jí)，從大到小逐層找，推理驗(yàn)證需要多方面進(jìn)行。

當(dāng)我們選好明星分子以后，調(diào)控層次就是要考慮的問(wèn)題了，這里說(shuō)的調(diào)控層次就是圍繞中心法則展開(kāi)對(duì)明星分子本身的探索，我們知道中心法則涉及到DNA-RNA-蛋白三個(gè)層面，根據(jù)調(diào)控的層次一般我們又分為轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平，轉(zhuǎn)錄我們知道是發(fā)生在細(xì)胞核里面的。所以我們看到某個(gè)分子定位在細(xì)胞核時(shí)我們一般就從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行考慮，比如轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA序列的結(jié)合，DNA甲基化、組蛋白修飾等等，而當(dāng)RNA被轉(zhuǎn)錄出來(lái)后要經(jīng)過(guò)加工過(guò)程，比如可變剪接，miRNA介導(dǎo)的降解，mRNA翻譯成蛋白，蛋白合成后會(huì)被磷酸化修飾或者泛素化修飾從而激活或者降解等等，這些是轉(zhuǎn)錄后的水平。那么我們?cè)诖_定明星分子后，一般來(lái)說(shuō)需要首先確定的是變化發(fā)生在哪個(gè)層面，是RNA還是蛋白，是蛋白的產(chǎn)生（翻譯）、降解（比如泛素化）還是活化（比如磷酸化），從而把研究的焦點(diǎn)集中到明星分子的某個(gè)過(guò)程，這個(gè)層面是圍繞一個(gè)明星分子的前世今生來(lái)展開(kāi)的。

4、工具分子
一個(gè)結(jié)果多個(gè)因素，工具分子一大群，具體哪個(gè)有作用，一般情況用免疫沉淀IP來(lái)驗(yàn)證準(zhǔn)確性。

確定了明星分子在哪個(gè)層面被調(diào)控后，就要找相應(yīng)的工具分子了，工具分子是指像酶（比如激酶、泛素酶、甲基化酶）、轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、剪接因子等為主的一系列蛋白，每個(gè)系列的工具分子一般都有很多，比如泛素酶就有成百上千個(gè)，那具體是哪一個(gè)導(dǎo)致明星分子被泛素化呢？以免疫沉淀（IP）技術(shù)為基礎(chǔ)延伸出來(lái)的各種分子就是用來(lái)找這類(lèi)工具分子的較常用策略，比如通過(guò)IP加質(zhì)譜鑒定與明星分子作用的泛素化酶，通過(guò)RNA pulldown加質(zhì)譜鑒定與RNA結(jié)合的工具蛋白（如翻譯因子和剪接因子），通過(guò)RIP-seq來(lái)尋找與蛋白結(jié)合的RNA，通過(guò)ChIP-Seq來(lái)尋找與蛋白結(jié)合的DNA序列（如靶基因）等等。找到工具分子后，作用的信號(hào)軸就有了：某基因（因素）通過(guò)（4）工具分子從（2）明星分子（3）某個(gè)層面調(diào)控（1）某條信號(hào)通路。

5、 具體位點(diǎn)
分子整體有作用，具體位點(diǎn)講不清，可以拆開(kāi)組合來(lái)驗(yàn)證。

這一步就是要進(jìn)一步把明星分子和工具分子進(jìn)行拆解，工具分子揍了明星分子一頓，具體是揍了一拳還是踢了一腳，工具分子的一拳打在了明星分子的臉上還是肚子上，這個(gè)是兩個(gè)要交代清楚的問(wèn)題，所以就要把工具分子和明星分子中發(fā)揮功能的位點(diǎn)、序列或者結(jié)構(gòu)域找到，找到后就可以更加清楚的描述了：工具分子左拳打在了明星分子頭上，具體位置是打在了太陽(yáng)穴上，把明星分子打死了，這樣導(dǎo)致一個(gè)以明星分子為中心的網(wǎng)絡(luò)（信號(hào)通路）出現(xiàn)崩潰或者癱瘓，異常（疾?。┚统霈F(xiàn)了。所以我們?cè)谖恼轮谐３？吹揭训鞍赘鶕?jù)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分段，把RNA根據(jù)序列長(zhǎng)度進(jìn)行分段，然后再看他倆之間還有沒(méi)有作用。

三、分子機(jī)制研究的五個(gè)層次
層次一：相關(guān)性；一般對(duì)應(yīng)的文章分?jǐn)?shù)在1-3分左右；
層次二：因果關(guān)系；一般對(duì)應(yīng)的文章分?jǐn)?shù)在3-5分左右；
層次三：直接作用；一般對(duì)應(yīng)的文章分?jǐn)?shù)在5-10分左右；
層次四：嵌套組合；一般對(duì)應(yīng)的文章分?jǐn)?shù)在10-20分左右；
層次五：觀念創(chuàng)新；文章的層次是CNS級(jí)別。
 

1、層次一：相關(guān)性
兩個(gè)因素的相關(guān)性是做機(jī)制研究的*層關(guān)系，也是弱的關(guān)系。這里的因素可以是藥物、基因、現(xiàn)象等等，比如基因A的表達(dá)水平與肝癌腫瘤病人的預(yù)后、藥物的濃度與細(xì)胞凋亡的比率等等。對(duì)于疾病的研究來(lái)說(shuō)，如果某因素與疾病進(jìn)展或者預(yù)后有強(qiáng)相關(guān)性，就可能把該因素作為疾病進(jìn)展或者預(yù)后的marker，比如甲胎蛋白AFP之于肝癌，所以有一類(lèi)研究稱(chēng)之為偽基礎(chǔ)研究，研究的名字比如：Prognostic Significance of gene A expression in B disease. 或者Association between gene A and B disease.

相關(guān)性是弱的邏輯聯(lián)系，因?yàn)閮蓚€(gè)因素之間存在相關(guān)性有可能是*沒(méi)有邏輯的，比如北京的房?jī)r(jià)與肺癌的發(fā)病率之間的相關(guān)性。

2、層次二：因果關(guān)系
在相關(guān)性的基礎(chǔ)上深入的一層關(guān)系是因果關(guān)系，即因果關(guān)系是相關(guān)性的子集。如果A基因表達(dá)或者突變與B疾病之間存在相關(guān)性，那么有可能把A因素作為B疾病的biomarker；如果A基因是B疾病的原因，那么可以通過(guò)干預(yù)A基因影響B(tài)疾病進(jìn)展。
  1）在分子機(jī)制研究中，因果關(guān)系的存在是要證明的*步，比如在進(jìn)行某中藥通過(guò)AMPK信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖的研究中，為了說(shuō)明某中藥調(diào)控AMPK信號(hào)通路，我們較常規(guī)的手段就是通過(guò)WB檢測(cè)AMPK信號(hào)通路以及下游分子的表達(dá)或者活化狀態(tài)，就是證明中藥Z劑量與AMPK通路分子表達(dá)的因果關(guān)系。
  2）為了證明因果關(guān)系的第二個(gè)部分就是挽救實(shí)驗(yàn)，即如果上調(diào)A因素導(dǎo)致了B結(jié)果的出現(xiàn)，對(duì)A因素的下調(diào)是否可以逆轉(zhuǎn)B結(jié)果的出現(xiàn)。

3、層次三：直接作用
承接第二個(gè)層次，如果A因素是導(dǎo)致B結(jié)果出現(xiàn)的原因，那么A因素是直接原因呢還是間接原因？對(duì)應(yīng)到分子機(jī)制研究中就是這樣：A基因的上調(diào)導(dǎo)致了B蛋白的磷酸化，那么A基因直接與B相互作用介導(dǎo)的（直接作用）還是通過(guò)C介導(dǎo)的呢？
  1）為了證明這一點(diǎn)，通常用分子間的直接作用來(lái)驗(yàn)證，比如蛋白與蛋白作用的co-IP，GSTPulldown，蛋白與RNA作用的RIP、RNApulldown，蛋白與DNA作用的CHIP、EMSA等等，就是為了判斷兩者之間的直接還是間接作用。
  2）在以分子為單位的研究中，第二部分就是“分子局部”研究，比如已經(jīng)證明了蛋白A與RNA B是直接結(jié)合的，“分子局部”研究就是確定蛋白A的什么局部（哪些氨基酸形成的結(jié)構(gòu)域）與RNA B的哪段序列直接結(jié)合。
做到這一步，絕大多數(shù)分子研究的深度就夠了，即使是top-levelCNS級(jí)別的文章要求也不過(guò)如此。

4、層次四：嵌套組合
既然第三層次分子機(jī)制的研究深度已經(jīng)夠CNS級(jí)別的文章了，第四層次就不僅僅是研究深度的問(wèn)題了，而是故事的豐富度，有一個(gè)觀點(diǎn)就是從第三層次到第四層次的升級(jí)：?jiǎn)尉€(xiàn)到多線(xiàn)的過(guò)渡，即把幾個(gè)第三層次的單線(xiàn)研究嵌套組合為一個(gè)故事，第三層次要求把一個(gè)故事的一條線(xiàn)講清楚，第四層次要求把一個(gè)故事的多條線(xiàn)講清楚，而多條故事線(xiàn)的匯總形式有很多：比如雙頭蛇模式、反饋回路模式等等。

比如在第三層次的研究中，已經(jīng)通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)證明了lncRNAA通過(guò)抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達(dá)，在第四層次中雙頭蛇模式是：lncRNAA 除了通過(guò)抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達(dá)（層次三），還可以通過(guò)ceRNA的方式下調(diào)microRNAC表達(dá)從而促進(jìn)B的表達(dá)；反饋回路模式則是：lncRNAA除了通過(guò)抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達(dá)（層次三），而上調(diào)表達(dá)的蛋白B促進(jìn)了lncRNAXXX的轉(zhuǎn)錄，從而形成正反饋回路。

5、層次五：觀念創(chuàng)新
層次五就是高層次，即觀念層面的創(chuàng)新，一般到這個(gè)層次就是CNS級(jí)別了，比如新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、兩個(gè)貌似沒(méi)有關(guān)系的現(xiàn)象之間聯(lián)系的揭示等，這點(diǎn)大家看CNS的文章應(yīng)該有感觸，舉個(gè)例子：外泌體的形成與細(xì)胞自噬之間有沒(méi)有關(guān)系呢？