細(xì)胞焦亡整體實(shí)驗(yàn)

1、提供細(xì)胞焦亡整體實(shí)驗(yàn)方案：客戶根據(jù)課題標(biāo)書及需做實(shí)驗(yàn)的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項(xiàng)目方案，含課題申請(qǐng)書，實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)思路，實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等與實(shí)驗(yàn)相關(guān)等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹?shí)驗(yàn)協(xié)助實(shí)驗(yàn)委托者完成細(xì)胞焦亡整體實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。

2、項(xiàng)目評(píng)估報(bào)價(jià)：公司技術(shù)團(tuán)隊(duì)根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評(píng)估項(xiàng)目可行性，與客戶共同確定準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)價(jià)格。嘉美實(shí)驗(yàn)協(xié)助設(shè)計(jì)的課題直接給出準(zhǔn)確的報(bào)價(jià)。

3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費(fèi)用，做好實(shí)驗(yàn)初步準(zhǔn)備及項(xiàng)目預(yù)安排。

4、執(zhí)行服務(wù)項(xiàng)目：正式啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，全面展開實(shí)驗(yàn)，確保項(xiàng)目有效執(zhí)行。

5、溝通項(xiàng)目進(jìn)展：及時(shí)溝通反饋實(shí)驗(yàn)的Newest進(jìn)展，隨時(shí)了解掌控實(shí)驗(yàn)的Newest動(dòng)態(tài)。

6、完成項(xiàng)目交付：支付剩余尾款，交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正確應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供售后服務(wù)。

 

一、細(xì)胞焦亡介紹
程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)，是指細(xì)胞接受某種信號(hào)或受到某些因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動(dòng)性消亡過(guò)程。凋亡、自噬、細(xì)胞程序性壞死、細(xì)胞焦亡都是是程序性死亡的表現(xiàn)形式。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡方式，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要天然免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)中發(fā)揮重要作用。相比于細(xì)胞凋亡（apoptosis），細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快，依賴于半胱天冬酶-1(caspase-1)，并會(huì)伴隨大量促炎癥因子的釋放。細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征、發(fā)生及調(diào)控機(jī)制等均不同于凋亡、壞死等其他細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞焦亡本質(zhì)上是由GSDMD（gasdermin D）蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞炎性壞死，與多種病理生理過(guò)程緊密相關(guān)。一旦發(fā)生，GSDMD 蛋白的 N - 端高聚并與脂類結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成孔洞，細(xì)胞逐漸膨脹至細(xì)胞破裂，終大量細(xì)胞內(nèi)含物如 IL-1β釋放，激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展，對(duì)細(xì)胞焦亡的深入研究有助于認(rèn)識(shí)其在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用，為臨床防治提供新思路。細(xì)胞焦亡主要通過(guò)炎癥小體介導(dǎo)包含Caspase-1在內(nèi)的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內(nèi)的多種Gasdermin家族成員發(fā)生剪切和多聚化，造成細(xì)胞穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。相比于細(xì)胞凋亡（apoptosis），細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快，并會(huì)伴隨著大量促炎癥因子的釋放。

細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生腫脹，在細(xì)胞破裂之前，細(xì)胞上形成凸出物（圖A），之后細(xì)胞膜上形成孔隙，使細(xì)胞膜失去完整性，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，此時(shí)，細(xì)胞核位于細(xì)胞*（圖B），隨著形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞核固縮，DNA斷裂。
 

二、細(xì)胞焦亡信號(hào)通路
分為依賴Caspase-1的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4、5、11的非經(jīng)典途徑。

1、依賴Caspase-1的經(jīng)典途徑
在細(xì)菌，病毒等信號(hào)的刺激下，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體作為感受器，識(shí)別這些信號(hào)，通過(guò)接頭蛋白ASC與Caspase-1的前體結(jié)合，形成多蛋白復(fù)合物，使Caspase-1活化，活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)；另一方面，活化的Caspase-1對(duì)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。

2、依賴Caspase-4、5、11的非經(jīng)典途徑
在細(xì)菌等信號(hào)的刺激下，Caspase-4、5、11被活化，活化的Caspase-4、5、11切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，一方面誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)；另一方面，誘導(dǎo)Caspase-1的活化，對(duì)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。

三、細(xì)胞焦亡的檢測(cè)方法
1、形態(tài)變化
  1）掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)
  2）TUNEL染色
  3）免疫熒光染色（GSDMD/GSDME）

2、檢測(cè)焦亡相關(guān)蛋白
  1）q-PCR/Western Blot方法檢測(cè)焦亡相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)水平（例如，Caspase-1、4、5、11；GSDMD ; CleavedCASP-3等）
 

  2）ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-18等炎癥因子的水平
  3）MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

四、細(xì)胞焦亡的研究領(lǐng)域
細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要的免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)中發(fā)揮重要作用。廣泛參與腫瘤、感染性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展。
1、細(xì)胞焦亡與感染性疾病
在病原體感染時(shí)，適度的細(xì)胞焦亡可清除致病微生物，而過(guò)度的細(xì)胞焦亡在導(dǎo)致細(xì)胞死亡的同時(shí)，釋放炎癥因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，造成發(fā)熱，低血壓、敗血癥等癥狀。以敗血癥為例，敗血癥是由致病菌侵入血液系統(tǒng)，并在其中生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素，引起全身性感染，Newest研究表明，細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg7沉默后，可激活細(xì)胞焦亡途徑。

2、細(xì)胞焦亡與代謝性疾病
因代謝障礙或代謝旺盛等原因引起的疾病稱為代謝性疾病，常見(jiàn)的有糖尿病、痛風(fēng)、糖尿病性心肌病等。以糖尿病性心肌病為例，由心肌細(xì)胞死亡引起，Newest的研究顯示高血糖可以造成活性氧的產(chǎn)生增加，進(jìn)而上調(diào)NF-κB和TXNIP，NF-κB又可以上調(diào)NLRP3、IL-1β前體以及IL-18前體的表達(dá)；TXNIP通過(guò)改變NLRP3的結(jié)構(gòu)激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞膜穿孔、破裂，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)；另一方面，活化的Caspase-1對(duì)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。

3、細(xì)胞焦亡與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括腦損傷，癲癇等。以癲癇為例，研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作可通過(guò)鉀離子外流等途徑激活NLRP1炎癥體，進(jìn)而激活依賴Caspase-1的焦亡途徑，導(dǎo)致癲癇進(jìn)一步發(fā)展。
 

4、細(xì)胞焦亡與動(dòng)脈粥樣硬化
在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中，炎癥被認(rèn)為是啟動(dòng)和驅(qū)動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素。在高血脂、氧化修飾的低密度脂蛋白等幾次下，激活Caspase-1，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的焦亡與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管擴(kuò)張功能障礙、壞死中心的形成，粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定，終造成動(dòng)脈粥樣硬化。
 

5、細(xì)胞焦亡與腫瘤
研究發(fā)現(xiàn)，在ROS及細(xì)胞毒素的作用下，JNK激酶被激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)焦亡相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)焦亡的形成，控制腫瘤的發(fā)展。
 

五、各種程序化壞死包括細(xì)胞焦亡的區(qū)別