免疫組化實驗外包服務(wù)
- 公司名稱 北京嘉美臻元生物技術(shù)有限公司
- 品牌
- 型號
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時間 2019/3/19 16:38:12
- 訪問次數(shù) 812
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產(chǎn)地類別 | 進(jìn)口 |
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嘉美免疫組化實驗特色介紹
一、嘉美實驗可以提供:實驗所需抗體,即提供一抗
二、嘉美實驗可以提供:提供一抗之外,所有免疫組化實驗試劑
三、實驗委托者只需要提供:組織、蠟塊、切片,任意一種標(biāo)本即可
一、免疫組化實驗介紹
免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽蛋白質(zhì)),對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。
二、免疫組化主要步驟(sABC法為例子)
1. 洗載玻片: 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中,將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys帶正電,而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷,從而產(chǎn)生吸附作用。
2. 包埋組織: 先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,后加入少許液體石蠟,進(jìn)行冷凍,使石蠟變成固態(tài)。
3. 切片:將包埋好的組織從模具上取下來,并置于石蠟切片機(jī)上,切片機(jī)通過調(diào)節(jié)上下左右來來使組織和切割方向*,然后調(diào)節(jié)切片的厚度,一般為5 um,如果比較難切,則可以適當(dāng)調(diào)整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4. 撈組織:當(dāng)組織載玻片置于40°C溫水中之前,要先將水浴中的氣泡趕走,以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,組織受熱展開,Best是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時,一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時候Best方向*,以便觀察,再將撈出來的載玻片置于架子上,放入37°C溫箱中烘干。
5. 脫蠟:依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-*酒精-*酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當(dāng)延長脫蠟時間,一般為12-15min.
6. 抗原修復(fù):脫蠟后在清水中沖洗一段時間,加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
7. 血清封閉:冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點封閉起來,然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍(血清封閉液)。
8. 加一抗:將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,加一抗,如果做對照實驗,就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。
9. 加二抗:將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
10. 加SABC: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍。
11. 加顯色劑: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻) A:DAB B:H2O2 C:磷酸緩沖液
12. 復(fù)染: 將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動物組織為半分鐘,植物組織3-5min。
13. 脫水:將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-*酒精-*酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min,后浸泡在二甲苯中,搬到通風(fēng)柜中。
14. 封片:用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側(cè),然后輕輕放下另一側(cè),以免產(chǎn)生氣泡,封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。
三、免疫組化試劑
【免疫組化的相關(guān)試劑】:重要的是選擇好一抗、二抗或者還有三抗,注意抗體的特異性、效價和交叉反應(yīng)。
【其他常用試劑有】:
1、0.01M(pH7.4)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS),稀釋抗體和洗片子用;
2、清潔液、純水,洗玻片用
3、多聚賴氨酸處理載玻片,防止脫片
4、固定液:4%多聚甲醛或冷丙酮等;
5、15%~30%蔗糖,組織脫水用;
6、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,或者OCT包埋做冰凍切片;
7、抗原修復(fù)液:枸櫞酸緩沖液(pH6.0);
8、活化劑:EDTA或者Triton X-100;
9、1%~10%牛血清清蛋白(BSA)封閉液;
10、H2O2,滅活內(nèi)源性過氧化物酶;
11、顯色液:根據(jù)你做的酶來選擇,如果是HRP就用DAB,如果是AKP,就用NBT/BCIP,免疫熒光則不需要;
12、50%緩沖甘油封片液。
四、免疫組化樣本說明
1、石蠟切片
取材:1、組織離體后需及時固定;2、組織標(biāo)本不宜過大、過厚。
固定:1、固定液:10%福爾馬林(4%多聚甲醛)或10%中性甲醛;2、用量:一般固定液的量與組織體積比為10:1~20:1;3、固定:適宜的固定時間,主要根據(jù)材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。
保存:切片經(jīng)60℃烤片3-5小時后,可于常溫或4℃干燥保存。
2、冰凍切片
取材:取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。
固定:樣本冰凍切片后,應(yīng)立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。
保存:固定好的切片自然風(fēng)干,密封后置于-80℃、-20℃保存,盡快用于后續(xù)實驗。
3、細(xì)胞塊石蠟切片
細(xì)胞量較多的樣品,可離心分離所需細(xì)胞,用中性甲醛固定后制作成瓊脂細(xì)胞塊,然后按照制作石蠟切片的操作流程進(jìn)行切片。
4、細(xì)胞爬片
在孔板里做的細(xì)胞爬片,爬片取出后,用PBS洗滌2次(根據(jù)研究目的,PBS洗滌可選擇不做),用4%多聚甲醛4℃固定15分鐘,將表面液體吹干,置于-20℃保存。若在短時間內(nèi)即開展實驗,可在加固定液后,于4℃冰箱中放置一段時間。
5、細(xì)胞涂片
細(xì)胞涂片常用的固定液有95%酒精(較為常用)、酒精-冰醋酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。
五、免疫組化實驗注意事項
1、常用的固定液為中性甲醛和4%多聚甲醛,能使大多數(shù)抗原保存良好,適用于免疫組織化學(xué)。
2、病理實驗切片Best是防脫片,以免實驗過程中出現(xiàn)掉片。若客戶提供切片,應(yīng)告知切片有無防脫處理。
3、骨組織、皮膚組織或脂肪含量較高的樣本,實驗過程中有較高的掉片幾率。
4、客戶可提供組織塊(以10%福爾馬林、4%多聚甲醛或10%中性甲醛固定,如組織塊極小請事先說明)、蠟塊或切片(使用免疫組化切片,以避免實驗過程中掉片)
5、待檢測蛋白的種屬、實驗分組情況及實驗背景資料、其他具體要求等需事先說明。
6、若客戶提供骨組織或鈣化程度較高的組織進(jìn)行實驗,需進(jìn)行脫鈣處理。
7、浸泡在固定液中的組織樣本,在運輸中容器需密封,防止破碎、滲漏。