原位雜交（ISH/FISH）實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介
熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。

二、實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理
用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

三、實(shí)驗(yàn)操作流程

1、探針變性：將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。
 

2、標(biāo)本變性：

  1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

  2）取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。

  3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)*冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
 

3、雜交：將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過(guò)夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。
 

4、洗脫：此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

  1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

  2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。

  3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。

  4）在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。
 

5、雜交信號(hào)的放大

  1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

  2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。

  3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。

  4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。

  5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。

  6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。

  7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。

  8）取出玻片，自然干燥。

  9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
 

6、封片：可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-80℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。
 

7、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果：先在可見(jiàn)光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開(kāi)熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針的探針?biāo)谖恢冒l(fā)出綠色熒光。
 

四、樣品要求

樣品制備無(wú)特殊要求；各種染色、非染色、熒光標(biāo)記的組織（包括活組織）、培養(yǎng)細(xì)胞、粘附細(xì)胞、細(xì)胞涂片、石蠟切片、冰凍切片。

1、石蠟切片

取材：1、組織離體后需及時(shí)固定；2、組織標(biāo)本不宜過(guò)大、過(guò)厚。

固定：1、固定液：10%福爾馬林（4%多聚甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量與組織體積比為10:1～20:1；3、固定：適宜的固定時(shí)間，主要根據(jù)材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存：切片經(jīng)60℃烤片3-5小時(shí)后，可于常溫或4℃干燥保存。

2、冰凍切片

取材：取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定：樣本冰凍切片后，應(yīng)立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。

保存：固定好的切片自然風(fēng)干，密封后置于-80℃、-20℃保存，盡快用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3、細(xì)胞塊石蠟切片

細(xì)胞量較多的樣品，可離心分離所需細(xì)胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細(xì)胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進(jìn)行切片。

4、細(xì)胞爬片

在孔板里做的細(xì)胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次（根據(jù)研究目的，PBS洗滌可選擇不做），用4%多聚甲醛4℃固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20℃保存。若在短時(shí)間內(nèi)即開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段時(shí)間。

5、細(xì)胞涂片

細(xì)胞涂片常用的固定液有95%酒精（為常用）、酒精-冰醋酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 
 

五、其他及注意事項(xiàng)

1、配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對(duì)粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；

2、加熱時(shí)，溫度不宜過(guò)高，常為60~65℃，否則，PFA降解失效；

3、配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過(guò)久的液體，固定效果下降，應(yīng)盡早使用。

4、4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時(shí)對(duì)形態(tài)保持也較好。樣品固定時(shí)間在2～3小時(shí)，RNA含量較為恒定。過(guò)度延長(zhǎng)固定時(shí)間會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過(guò)度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。