原位雜交（ISH/FISH）實驗

一、實驗技術簡介
熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待許多領域。

二、實驗技術原理
用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。

三、實驗操作流程

1、探針變性：將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。
 

2、標本變性：

  1）將制備好的染色體玻片標本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。

  2）取出玻片標本，將其浸在70～75℃的體積分數70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。

  3）立即按順序將標本經體積分數70%、體積分數90%和體積分數*冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
 

3、雜交：將已變性或預退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。
 

4、洗脫：此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。

  1）雜交次日，將標本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

  2）將已雜交的玻片標本放置于已預熱42～50℃的體積分數50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。

  3）在已預熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。

  4）在室溫下，將玻片標本2×SSC中輕洗一下。
 

5、雜交信號的放大

  1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

  2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。

  3）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。

  4）在玻片標本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。

  5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。

  6）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。

  7）重復步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。

  8）取出玻片，自然干燥。

  9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。
 

6、封片：可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-80℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。
 

7、熒光顯微鏡觀察FISH結果：先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，FITC的激發(fā)波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經FITC標記的探針的探針所在位置發(fā)出綠色熒光。
 

四、樣品要求

樣品制備無特殊要求；各種染色、非染色、熒光標記的組織（包括活組織）、培養(yǎng)細胞、粘附細胞、細胞涂片、石蠟切片、冰凍切片。

1、石蠟切片

取材：1、組織離體后需及時固定；2、組織標本不宜過大、過厚。

固定：1、固定液：10%福爾馬林（4%多聚甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量與組織體積比為10:1～20:1；3、固定：適宜的固定時間，主要根據材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存：切片經60℃烤片3-5小時后，可于常溫或4℃干燥保存。

2、冰凍切片

取材：取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定：樣本冰凍切片后，應立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。

保存：固定好的切片自然風干，密封后置于-80℃、-20℃保存，盡快用于后續(xù)實驗。

3、細胞塊石蠟切片

細胞量較多的樣品，可離心分離所需細胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進行切片。

4、細胞爬片

在孔板里做的細胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次（根據研究目的，PBS洗滌可選擇不做），用4%多聚甲醛4℃固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20℃保存。若在短時間內即開展實驗，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段時間。

5、細胞涂片

細胞涂片常用的固定液有95%酒精（為常用）、酒精-冰醋酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 
 

五、其他及注意事項

1、配制時應在通風條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；

2、加熱時，溫度不宜過高，常為60~65℃，否則，PFA降解失效；

3、配制好的PFA雖可存放一定時間，但過久的液體，固定效果下降，應盡早使用。

4、4% PFA是目前原位雜交組織化學技術中常用的固定液，它能較好地保持組織及細胞內的RNA，同時對形態(tài)保持也較好。樣品固定時間在2～3小時，RNA含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細胞內生物大分子的過度交聯，影響探針的穿透力，降低雜交效率。