草魚出血熱病毒（GCHV）熒光PCR檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：草魚出血熱病毒（GCHV）核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Grass Carp Hemorrhagic Fever Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包裝規(guī)格】48 份/盒

【預期用途】

本試劑盒適用于檢測的魚的腦、肝、腎、脾、腮等組織、雌魚的卵巢液等標本

中草魚出血熱病毒 RNA，適用于草魚出血熱病毒感染的輔助診斷。其檢測結果僅供

參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對草魚出血熱病毒特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一

步法熒光 RT-PCR 技術對草魚出血熱病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對

可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μl×1 管

GCHV 反應液 1.0ml×1 管

GCHV 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次，

有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ

Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

對于有臨床癥狀的魚，如體長不大于 4cm，取整條魚，體長 4~6cm 的魚，取內(nèi)

臟（包括腎）；體長大于 6cm 的魚則取腦、肝、腎、脾；對于無癥狀的魚，取腎、脾、

腮和腦組織，成熟雌魚還需取卵巢液。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標

本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.05g 于

研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管

中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL 滅菌離心管中；卵巢液直接取

100uL。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取

法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑 GCHV 反應液 酶液

用量 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應的反

應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿

選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲

線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15

范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value

值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35.0<Ct 值≤37，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35.0<Ct

值≤37，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結果 Ct 值>37 或無 Ct 值。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

Ø 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測不準確的結果；

Ø 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 產(chǎn)品性能指標

陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率

為 100％。

低檢測限：5.0×102copies/ml。

精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。

【注意事項】

Ø 所有操作嚴格按照說明書進行；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø 反應液應避光保存；

Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全

通則》進行處理。

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