多重?zé)晒馓结楶CR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng)：禽流感病毒 H7N9 (AIV-H7N9)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Avian Influenza virus subtype H7N9 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

禽流感是由 A 型流感病毒所引起的禽類(lèi)疾病。AIV 除了感染禽類(lèi)外，部分亞型也

能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對(duì)其不致病，當(dāng)它

們傳染給其它物種時(shí)有時(shí)會(huì)造成大的發(fā)病率和死亡率。2013 年我國(guó)*報(bào)道了人感

染 H7N9 型 AIV，至 2015 年有 571 例感染，212 人死亡。H7N9 AIV 對(duì)禽類(lèi)表現(xiàn)低

致病性，它引起家禽很輕微的或不引起臨床癥狀，但對(duì)人卻表現(xiàn)很高的致病性[1]。

本試劑盒適用于檢測(cè)標(biāo)本中的禽流感病毒 H7N9，適用于禽流感病毒 H7N9 感染

的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒分別對(duì)禽流感病毒 H7N9 亞型的 HA 和 NA 基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探

針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)禽流感病毒 H7N9 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用

于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名 稱(chēng) 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H7N9 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

AIV-H7N9 陽(yáng)性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批號(hào)試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 9 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 系列 、安 捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取

呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本

運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨

器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，

8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100

μL 提取。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提

取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)

照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 AIV-H7N9 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道

（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI

系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)

整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)

節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)

閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為禽流感病毒 H7N9 亞型 H7 基因檢測(cè)結(jié)果，CY5 通道為禽流感病毒

H7N9 亞型 N9 基因檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線。

可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試

驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú) Ct 值且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。

6. 檢測(cè)方法的局限性

Ø 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

Ø 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定

量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

Ø 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線且無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32；

以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

【注意事項(xiàng)】

Ø 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

Ø 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

Ø 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

Ø 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通

則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13. [2] 羅思思, 謝芝勛, 劉加波, 等. H7N9 亞型 AIV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)方

法的建立[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(12):1-5. [3] 徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重?zé)晒?RT-PCR 檢

測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 12, 36: 939-942.

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