無動物參與的皮膚致敏試驗方法

ADRA試劑盒

　　ADRA（Amino acid Derivative Reactivity Assay，氨基酸衍生物反應(yīng)法）是應(yīng)用了N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-cysteine【NAC】和α-N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-lysine【NAL】的化學(xué)品皮膚致敏試驗方法，該方法無動物參與，是動物皮膚致敏試驗的替代方法，符合OECD TG442C（經(jīng)濟合作與發(fā)展組織化學(xué)品 TG442C測試準(zhǔn)則）。

◆原理

皮膚致敏是由致敏物質(zhì)與蛋白結(jié)合形成復(fù)合物（KE1）開始的，該復(fù)合物通過致敏物質(zhì)與蛋白中的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基的共價結(jié)合所得。ADRA試驗利用NAC（半胱氨酸衍生物）和NAL（賴氨酸衍生物）替代蛋白，通過NAC、NAL和待測物質(zhì)的反應(yīng)來預(yù)測待測物質(zhì)與蛋白的結(jié)合性。

ADRA試驗通過將NAC、NAL溶液與待測物溶液混合，在25°C下反應(yīng)24小時，然后用HPLC法對反應(yīng)溶液中殘留的NAC和NAL的濃度進行定量，從而對待測物質(zhì)的皮膚致敏性進行評估。

◆優(yōu)點

●　靈敏度高：在相對長的波長下（281 nm）檢測，可防止待測樣品和親核試劑的共洗脫。

●　沉淀少：ADRA試驗所需反應(yīng)物的濃度僅為DPRA法的1%，可避免沉淀的產(chǎn)生。

●　重復(fù)性好：在HPLC分析前，通過添加終止液（2.5％TFA）來終止反應(yīng)，因此檢測的可重復(fù)性好。

●　高通量：ADRA試驗使用96孔板和多通道移液器，可在短時間內(nèi)測定多個樣品。

◆試劑盒組成

◆使用方法

　　用水將預(yù)混合緩沖液溶解，再將NAC和NAL溶于其中，然后在96孔板與待測物反應(yīng)24小時后，通過HPLC即可進行分析。

　　預(yù)混緩沖液、NAC和NAL都已經(jīng)按照反應(yīng)所需的量分裝好，只需進行溶解即可用于ADRA試驗。

◆操作視頻

●  緩沖液的制備

●  Day1 反應(yīng)溶液的制備 

●  Day2 反應(yīng)的終止

◆其他需要用到的試劑·實驗器材

試劑

* 蒸餾水或更高級別的水（ADRA試驗需要使用金屬含量低的水。）

* * 請勿在被測物質(zhì)溶于水或乙腈時使用。

※ 需要用苯.乙醛 (CAS RN^® 122-78-1)作為陽性對照化合物。

實驗器材

●　電子天平：精.準(zhǔn)到0.1 mg

●　微量移液槍：量程為2～10 µL、10～100 µL和100～1000 µL的3種移液槍

●　12道移液器：量程為50～150 µL

●　HPLC系統(tǒng)：配套96孔用遮光自動進樣器，以0.3 mL/min流速進樣

●　UV檢測器：二極管陣列檢測器（PDA檢測器）或吸光度檢測器（281 nm）

●　HPLC柱：Wakopak^® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150 mm（粒徑：3.6 μm）（產(chǎn)品編號：233-63991）

●　HPLC柱：或同類型產(chǎn)品

●　pH計：pH可讀取到±0.01，并配套校準(zhǔn)用緩沖液

●　恒溫箱：溫度可設(shè)定為25℃

●　96孔板

●　500 mL PE瓶

●　試管混合器

●　微孔板封板膜：島津GLC封板膜（產(chǎn)品編號：568-RES001）或同類型具有高密封性和耐溶劑性的產(chǎn)品

●　微孔板振蕩器

●　微孔板離心機

◆產(chǎn)品列表

◆相關(guān)產(chǎn)品

ADRA色譜柱（http://www.muquzhou.cn/st301933/product_32397444.html）

◆相關(guān)應(yīng)用

皮膚致敏試驗替代法ADRA應(yīng)用實例：使用Wakopak^® Core C18 ADRA色譜柱對"ADRA"中常見化合物進行分析（http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/gories/show/156.html）