細胞水平氧化應激標記物丙.烯醛的檢測試劑

AcroleinRED

本試劑能與劇毒的不飽和醛——丙.烯醛進行特異性反應，并通過紅色熒光使其可視化。它不和其他不飽和醛或脂質代謝物等進行反應，因此可以從活細胞中檢測出內源性丙.烯醛或由外部刺激而過量產生的丙.烯醛，并且可進行相對定量。

※本產品基于理化學研究所開拓研究本部田中生體機能合成化學實驗室的研究成果商品化而成。

※ 本產品僅供研究用。請勿用于研究以外的其他用途。

◆丙.烯醛是什么？

丙.烯醛（Acrolein；2-propenal）是具有極其簡單結構的α，β不飽和醛。因其化學活性高，近年來作為氧化應激標記備受矚目。丙.烯醛的產生源十分廣泛，具體可分為環(huán)境因素和生理因素。已知的環(huán)境因素有：烹飪食品時可能產生丙.烯醛（特別是油炸肉或魚，烘烤或燒焦時等等），以及飲酒、香煙中的煙霧、排氣導致丙.烯醛的生成（燃燒有機物）等。另外，在生理因素方面，有報道稱丙.烯醛在生物體內經常作為代謝副產物被合成，如在脂質過氧化反應，蘇氨酸和蛋氨酸的酶依賴性代謝反應，多胺氧化反應以及由于細胞暴露而產生的氧化應激反應。

由于丙.烯醛的化學反應活性非常高，它能與生物體內各種親核基團結合（蛋白質、核酸和脂質等），從而破壞其功能，因此它作為一種具有強毒性的氧化應激標記物開始為人們認知。近年研究表明，丙.烯醛的毒性高于有名的氧化應激標記物，活性氧（Reactive Oxidative species；ROS）。它不僅在基礎生物學，在制藥、環(huán)境科學、食品產業(yè)、健康產業(yè)等廣泛地生命科學領域中也備受矚目。然而，由于丙.烯醛結構簡單且反應活性高，導致其檢測困難且難以對它進行詳細分析。

丙.烯醛的結構式

■　傳統(tǒng)的丙.烯醛檢測方式

在傳統(tǒng)法中，想要檢測丙.烯醛十分困難，通常會利用丙.烯醛的α，β-不飽和醛結構的化學反應進行檢測。以下列舉兩種具有代表性的方法。

1）檢測FDP

丙.烯醛能與生物體內蛋白的胺緩慢反應，生成3-甲?；?3,4-脫氫哌啶（FDP）。通過使用能識別FDP的抗體，間接檢測并定量丙.烯醛的方法得到廣泛應用。然而，有研究人員提出了該方法的缺點：①畢竟FDP只是眾多丙.烯醛反應物中的一種，憑借抗FDP抗體對丙.烯醛的評價并不充分；②由于 FDP的生成十分緩慢，無法在高靈敏度下觀察丙.烯醛的生成。另外，由于使用抗體，因此不適用于活細胞實驗（見上圖方法一）。

2）利用HPLC檢測

通過使用3-氨基丙醇與丙.烯醛發(fā)生選擇性的熒光反應，然后使用HPLC熒光分析對具有熒光性的生成物7-羥基喹啉進行定量。但是由于丙.烯醛的高活性和揮發(fā)性，無法輕易將其分離，生成物的熒光靈敏度低、通量低，且無法避免細胞破裂，無法檢測活細胞的丙.烯醛含量（見上圖方法二）。

◆AcroleinRED的原理

AcroleinRED是利用了理化學研究所田中克典主任研究員等人所發(fā)現(xiàn)的苯基疊氮化合物與丙.烯醛發(fā)生特異性環(huán)化反應時所用到的試劑。

■　苯基疊氮化合物丙.烯醛的特異性反應

苯基疊氮化合物與丙.烯醛特異性地且迅速地發(fā)生反應，生成環(huán)狀產物4-甲?；?,2,3-三唑啉。4-甲?；?,2,3-三唑啉能與附近的生物分子非特異性結合并形成共價鍵。

■　利用AcroleinRED檢測丙.烯醛的原理

利用AcroleinRED檢測丙.烯醛的原理可以分為細胞內外兩條途徑。

①檢測細胞內丙.烯醛

AcroleinRED擁有膜通透性，能夠穿透細胞膜，在細胞內與丙.烯醛反應并形成4-甲?；?,2,3-三唑啉。

②檢測釋放到細胞外的丙.烯醛

細胞膜脂質過氧化反應所產生的丙.烯醛被釋放到細胞外。丙.烯醛與細胞外的AcroleinRED迅速反應，反應生成物4-甲?；?,2,3-三唑啉通過胞吞進入到細胞中。

無論是①，②哪條途徑的反應生成物4-甲?；?,2,3-三唑啉，都會隨機地與生物分子（蛋白等）反應，后在細胞內將細胞染色。

※    請注意，本試劑不能用于局部觀察。由于丙.烯醛與試劑的反應生成物以及附加在生物分子的狀態(tài)都會通過熒光

※    信號被檢測出，因此并不能使丙.烯醛局部可視化。

◆特點

●　AcroleinRED是利用了苯基疊氮化合物與丙.烯醛特異性且迅速發(fā)生反應這一原理的試劑。通過使用TAMRA染料

●　標記從細胞中產生的丙.烯醛，使丙.烯醛可視化。

●　可使用羅丹明濾光片組件觀察（激發(fā)/熒光波長：560 nm/585 nm）。

●　不與其他不飽和醛（巴豆醛，反式2-辛烯醛，異丁烯醛）、苯乙烯反應。

●　無需前處理，簡單地操作即可檢測。

●　與現(xiàn)有丙.烯醛定量法相比，靈敏度高。（丙.烯醛濃度的檢測上限：100 nM）

●　可根據(jù)熒光強度相對定量丙.烯醛。

◆原著論文

●　A. R. Pradipta, M. Taichi, I. Nakase, E. Saigitbatalova, A. Kurbangalieva, S. Kitazume, N. Taniguchi,

●　K. Tanaka, ACS Sens., 1, 623～632 (2016).

●　Uncatalyzed Click Reaction between Phenyl Azides and Acrolein: 4-Formyl-1,2,3-Triazolines as

●　“Clicked” Markers for Visualizations of Extracellular Acrolein Released from Oxidatively Stressed

●　Cells.

●　T. Tanei, A. R. Pradipta, K. Morimoto, M. Fujii, M. Arata, A. Ito, M. Yoshida, E. Saigitbatalova, A.

●　Kurbangalieva, J. Ikeda, E. Morii, S. Noguchi, and K. Tanaka, Adv. Sci., 1801479 (2018)

●　Cascade reaction in human live tissue allows clinically applicable diagnosis of breast cancer

●　morphology.

◆應用

●　穩(wěn)態(tài)下對丙.烯醛產生量進行相對定量

●　對因外部刺激（藥劑處理等）導致丙.烯醛產生量變動進行相對定量

※    不可用于丙.烯醛的局部觀察。詳情請瀏覽本文“原理”部分。

◆操作方法概要

1.　使用新鮮的培養(yǎng)基制備AcroleinRED溶液（終濃度10~30 μM）。

1.　※ 終濃度可能會因為細胞種類不同而有所差別，建議根據(jù)實驗進行優(yōu)化。

2.　去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。

3.　添加含有AcroleinRED的培養(yǎng)基。

4.　培養(yǎng)30分鐘~1小時。

1.　※ 注意：熒光信號會隨處理時間的增加而積累。請根據(jù)實驗選擇理想的處理時長。

5.　用PBS清洗細胞3次，更換新的培養(yǎng)基。

6.　可以觀察非固定細胞（活細胞）及固定細胞。

◆應用實例

■　驗證苯基疊氮化合物的丙.烯醛特異性

■　依賴于氧化應激的丙.烯醛的產生量增加

在氧化應激模型中，將0~1，000 μM的各濃度的過氧化氫H₂O₂添加至HUVEC細胞中預孵育2小時后，添加AcroleinRED并在30分鐘后進行非固定觀察。在未添加H₂O₂時可觀察到穩(wěn)態(tài)下丙.烯醛的產生量。另外，可以發(fā)現(xiàn)隨著H₂O₂濃度的增加，丙.烯醛的生成量也不斷增加。

■　ROS產生促進劑使丙.烯醛產生量增加

使用能促進細胞內活性氧（ROS）產生的物質甲萘醌對細胞處理0、10、30、60分鐘后，分別使用ROS檢測試劑以及AcroleinRED進行共染色?？捎^察到經甲萘醌處理后，細胞的ROS迅速增加，而丙.烯醛則是緩慢增加。

■　不同細胞種類所產生的丙.烯醛產生量比較

使用AcroleinRED對3種正常細胞以及8種人癌細胞株進行丙.烯醛產生量的相對比較。結果表明，與正常細胞相比，癌細胞中丙.烯醛的產生量明顯增加。并且發(fā)現(xiàn)每種癌細胞的丙.烯醛的產生量之間也有差別。

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■　組織中丙.烯醛的可視化

將乳腺癌患者來源乳腺組織（IDC，浸潤性導管癌, DCIS，原位導管癌）以及正常乳腺組織（NBG）提取后立刻以非固定狀態(tài)浸于AcroleinRED（20 μM）/Hochest混合溶液中，靜置5分鐘后染色丙.烯醛和細胞核，清洗組織后使用熒光顯微鏡觀察。

結果表明，AcroleinRED處理過的乳腺癌組織（IDC，DCIS）中可以觀察到紅色熒光，但正常乳腺癌組織（NBG）卻基本無法觀察到經過AcroleinRED處理的染色。通過這種方法，可以對非固定狀態(tài)下的提取組織進行染色。

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