PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit

PKH26紅色熒光細(xì)胞鏈接試劑盒

PKH26 紅色熒光細(xì)胞鏈接試劑盒PKH26 紅色熒光細(xì)胞鏈接試劑盒

產(chǎn)品簡介
    PKH26是一種磚利的膜標(biāo)記探針,結(jié)構(gòu)上帶有-長脂肪族尾巴，能穩(wěn)定插入細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)域。PKH26熒光處于黃橙色光譜區(qū)間(見圖1) , *大激發(fā)波長為551nm,*大發(fā)射波長是567nm ,與羅丹明或PE檢測系統(tǒng)兼容。也可能用標(biāo)準(zhǔn)熒光素( Fluorescein)激發(fā)濾片,但熒光強(qiáng)度可能會(huì)有些降低。PKH26具 *長的體內(nèi)半衰期，超過100天。

本產(chǎn)品PKH26熒光細(xì)胞連接試劑盒采用擁有磚利的膜標(biāo)記技術(shù)，磚利膜標(biāo)記技術(shù)，穩(wěn)定的與細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出紅色熒光，染色方式依賴于細(xì)胞與膜的類型，主要用于細(xì)胞體外標(biāo)記、體外細(xì)胞增殖研究及體內(nèi)外細(xì)胞示示蹤研究。

 產(chǎn)品組成

自備材料

1、充分分散的單個(gè)細(xì)胞懸液

2、含血清的組織培養(yǎng)基（*培養(yǎng)基）

3、無Ca2+，Mg2+和血清的培養(yǎng)基或者緩沖鹽（如Dulbecco’s PBS或Hank’s BSS）

4、血清，白蛋白或其它組織兼容性蛋白

5、離心管（4-15mL）

6、溫控離心機(jī)（1,000×g）

7、熒光分析設(shè)備（熒光讀板機(jī)，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細(xì)胞儀）

8、層流罩

9、血球計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)器

10、載玻片和蓋玻片

操作方法（下列過程*終體積為2mL，含2uM PKH26，以及1×107cells/mL細(xì)胞濃度）

（以下過程均在室溫下進(jìn)行（20-25℃）
1. 將2×107個(gè)細(xì)胞于離心管中，用不含血清培養(yǎng)基洗一遍。

【注意】血清蛋白和脂質(zhì)會(huì)與染料結(jié)合，降低與細(xì)胞膜結(jié)合的染料濃度。*好在用稀釋液C重懸細(xì)胞染色前（第四步）用無血清培養(yǎng)基或緩沖液洗細(xì)胞一次（**步）。

2. 400×g離心5分鐘。【注意】PKH26染料不能直接加到離心沉淀中，這樣會(huì)造成細(xì)胞染色不均一和細(xì)胞活力降低。

3. 離心后，小心吸棄上層清液，剩余上層細(xì) 胞液體積不超過25μL。

【注意】為得到可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在用稀釋液C重懸時(shí)，減少殘留培養(yǎng)基或緩沖液體積非常重要。

4.加入1mL稀釋液C用移液管輕輕吹打混勻，制備  2×細(xì)胞懸液。不要用振蕩器震蕩，不要讓 細(xì)胞在稀釋液C中保存太長時(shí)間。

【注意】生理鹽（physiologic salts）的存在會(huì)使得染料結(jié)團(tuán)并大幅降低染色效率。因此，需確保染色時(shí)細(xì)胞懸浮于稀釋液C中，不含培養(yǎng)基或緩沖鹽。

5.臨染色之前，將4μL PKH26乙醇溶液加 入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的  2×染色液（4×10-6M）。

【注意①】：為減少乙醇對(duì)細(xì)胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇*終濃度不能超過1-2%。

【注意②】：如果所需染料*終濃度＜2×10-6M，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一單獨(dú)的容器中，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。

6. 快速將1mL 2×細(xì)胞懸液（步驟4）加入  1mL 2×染色液（步驟5）中，立即用移液 管混勻。*終細(xì)胞濃度為1×107/mL，PKH26濃度為2×10-6M。

【注意】：由于染色瞬間完成，快速將細(xì)胞與染料混勻?qū)Φ玫矫髁痢⒕鶆蚝涂芍貜?fù)的標(biāo)記結(jié)果非常重要。下列措施有助于得到較優(yōu)的結(jié)果：

a.不要將PKH26染料直接加入含2×細(xì)胞的稀釋液C中。

b.將2×細(xì)胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混合。

c.調(diào)整2×細(xì)胞和2×染料的濃度避免染色 體積太?。ǎ?00μL）或太大（＞5mL）。

d.用電動(dòng)移液器快速將細(xì)胞和染料混勻。 血清移液管混勻速度太慢而使得染色不 均勻。Racking和旋渦震蕩混勻同樣混勻 較慢，染色均一性較差。

e.分配體積盡量準(zhǔn)確，以保證樣品與樣品 之間，實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的可重復(fù)性。

7.混勻后的染色的細(xì)胞孵育1-5 min。由于 染色速度較快，延長孵育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有幫助。

【注意】：讓細(xì)胞在染色液中停留盡量短的時(shí)間，同時(shí)保證得到理想的染色強(qiáng)度。因?yàn)橄♂屢篊缺少生理性鹽，過長時(shí)間的暴露在稀釋液C中會(huì)造成某些細(xì)胞活力降低。如果不能確定其影響程度，可增加僅作稀釋的對(duì)照組和只用乙醇而不用染料染色的對(duì)照組。

8. 加入等體積的血清（2mL）或其它合適的蛋白溶液（如1% BSA）終止反應(yīng)，孵育1min以結(jié)合多余的染料。

【注意①】：血清（或等效的蛋白濃度）為*優(yōu)的終止液。如果用*培養(yǎng)基替代，添加體積為10mL。

【注意②】：不要通過加稀釋液C或離心來終止反應(yīng)。

【注意③】：不要用無血清培養(yǎng)基或緩沖鹽，他們會(huì)使染料產(chǎn)生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈，使得分析過程中仍存在未標(biāo)記的細(xì)胞。

9.將細(xì)胞在20-25℃條件下400×g離心10min，小心吸棄上清。用10mL*培養(yǎng)基重懸，將重懸液轉(zhuǎn)移至另一新的無菌離 心管中，20-25℃條件下400×g離心5 min。用10mL*培養(yǎng)基再清洗兩遍以除去沒 結(jié)合的染料。

【注意①】：將重懸液轉(zhuǎn)移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對(duì)洗滌效率的影響；

【注意②】：不要用稀釋液C清洗。

10. *后一步清洗后，用10mL*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞評(píng)估細(xì)胞回收率，細(xì)胞活率和熒 光強(qiáng)度（圖2。離心重懸細(xì)胞至所需活細(xì) 胞濃度。

【注意①】：染色后的細(xì)胞可以用中性甲醛固定，避光條件下，熒光強(qiáng)度至少3周內(nèi)保持穩(wěn)定。

【注意②】：染色熒光強(qiáng)度一般為背景的100-1000倍。雖然染色的CV值與細(xì)胞種類有關(guān)，但熒光分布應(yīng)該盡量均勻?qū)ΨQ。

11、MC-38 TIL細(xì)胞用上述PKH26濃度染色，*終細(xì)胞濃度為1×107/ml。活力（▲）由FITC染色測定，平均熒光強(qiáng)度（●）用流式細(xì)胞儀檢測。用20μM PKH26標(biāo)記后，抗腫瘤TIL特異性和效能沒有改變。

 運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。2-8℃保存，有效期1年。PKH26乙醇溶液冷藏保存。保證染料乙醇溶液瓶蓋蓋緊減少蒸發(fā)以防止染料濃度升高。

 注意事項(xiàng)

1、親脂性染料結(jié)合到細(xì)胞膜上完成標(biāo)記。染色強(qiáng)度是染料濃度和細(xì)胞濃度的函數(shù)，與滲透性無關(guān)。因此，保證染料添加量不過量非常關(guān)鍵。過標(biāo)記的細(xì)胞將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性缺失或降低細(xì)胞活性。

2、本品可用于體內(nèi)體外細(xì)胞的標(biāo)記，包括干細(xì)胞、**細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或者任何其他細(xì)胞。體內(nèi)細(xì)胞的標(biāo)記過程需一定的改進(jìn)，如血小板的染色，或者選擇性標(biāo)記吞噬細(xì)胞。

3、本品染色過程中細(xì)胞濃度和染料濃度代表操作的起始濃度。該濃度被證明適用于多種細(xì)胞。使用者需通過評(píng)估染色后細(xì)胞活率（如，PI染色）、熒光強(qiáng)度、染色均勻度及是否對(duì)所研究細(xì)胞功能有影響等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模_定*優(yōu)的染料濃度和細(xì)胞濃度。

4、雖然貼壁細(xì)胞也可以染色，但單個(gè)懸浮細(xì)胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶（trypsin/EDTA）將貼壁細(xì)胞消化成單個(gè)懸浮細(xì)胞后再染色效果更佳。

5、PKH26染色過程中，不能存在疊氮化物或代謝毒性物。

6、熒光染料均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

7、該染料避光保存，使用前觀察是否有結(jié)晶。如出現(xiàn)結(jié)晶，室溫防止30min，然后超聲或震蕩直至溶解。

8、稀釋液C可室溫或冷藏保存。如果冷藏保存，使用前復(fù)溫至室溫。稀釋液C為無菌溶液，不含任何防腐劑和***，其需保持無菌。不要將染料儲(chǔ)存于稀釋液C中。溶于稀釋液C的工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，且配好后需立即使用。