特異性標記、純化ER駐留蛋白的試劑盒

ER-Protein Capture Kit

ER-Protein Capture kit是一款利用熒光標記物特異性標記ER駐留蛋白，再使用標簽捕獲抗體通過免疫沉淀法純化標記蛋白的試劑盒?？捎糜贓R相關蛋白的全面鑒定與定量分析有或無刺激（例如內質網應激）下靶蛋白的ER駐留量。

※　本產品是funakoshi基于京都大學工學研究科浜地格教授、田村朋則講師的研究成果商品化銷售的產品。

※　本產品僅供研究使用。研究以外不可使用。

◆ER蛋白的回收方法與問題點

ER （內質網；Endoplasmic Reticulum）是一種通常在細胞內占據(jù)約20%體積的細胞器，結構非常復雜且遍布整個細胞。ER是負責細胞內蛋白質生物合成的中央細胞器，在多肽鏈合成、通過伴侶蛋白適當折疊、排除異常蛋白等，從生物合成到品質管理中起著重要作用。ER還擔任分泌路徑的一部分，是細胞膜蛋白和細胞外分泌蛋白通過的細胞器。另外，它還被認為對于脂質代謝和脂肪滴形成十分重要，因此能夠分離、鑒定并定量分析ER蛋白的方法備受期待。然而，不同于其他細胞器，特異性純化ER的的技術十分貧乏，選擇性回收ER蛋白并不容易。

ER Protein Capture Kit是由京都大學浜地格教授、田村朋則講師等開發(fā)的基于ER駐留蛋白標記技術商品化的ER蛋白選擇性標記、純化試劑盒。通過使用ER駐留蛋白標記試劑ERM （ER-localizable Reactive Molecule），可以利用熒光標記物標記ER駐留蛋白，然后通過針對該標記物的特異性抗體進行純化，選擇性回收ER蛋白。無需超速離心機等特殊的機器，僅需簡單操作便可純化ER蛋白。除了能夠通過蛋白組學進行全面鑒定外，本產品還適用于相對定量分析各種刺激處理下的ER駐留量。

◆試劑盒內容

本試劑盒由兩部分組成。

A：ER駐留蛋白標記試劑ERM

A：（本試劑與產品名稱為ERseeing、產品編號FDV-0038為同一試劑?？蓡为氋徺I，也可以用作ER成像試劑）

B：標簽捕獲抗體（純化兔多克隆IgG抗體）

A：※ 產品不包含用于細胞裂解液制備用的溶解緩沖液或免疫沉淀所需的Protein A / G樹脂等。請另行購買。

◆原理和實驗流程

ER駐留蛋白標記試劑ERM是一種在ER駐留性綠色熒光色素（Rhodol衍生物）上綴合蛋白標記基團的化合物。將ERM添加到活細胞后，由于色素部分的特性，顯示出較高的ER駐留性。在ER中迅速濃縮后，通過蛋白標記基團用熒光標記物標記ER蛋白物（Step-1）。標記反應后破碎細胞制備細胞裂解液（Step-2），然后通過使用標簽捕獲抗體（抗Rhodol抗體）進行免疫沉淀（Step-3），可以選擇性地回收被ERM標記的ER蛋白。由于回收的蛋白上帶有熒光基團，使用SDS-PAGE分離后，可以通過CBB/銀染或熒光成像儀檢測出來（Step-4）。進行SDS-PAGE分離后，可以通過LC / MS進行全面蛋白組學分析或使用任何抗體的蛋白印跡法鑒定ER蛋白。

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◆原著論文

Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060～17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

◆實驗參考數(shù)據(jù)

■ ERM的激發(fā)/發(fā)射光譜

■ 激發(fā)光譜（藍）以及發(fā)射光譜（綠）

■ ※ 適用于普通的綠色熒光色素FITC觀察條件

■ ER特異性檢驗

■ 通過與各種細胞器標記共染色評價本試劑的ER特異性。觀察到ERM（100 nM）與ER標記試劑高度共定位（皮爾遜相關系數(shù)>0.9）。另一方面，未觀察到本試劑與溶酶體標記、線粒體標記的共定位。高爾基體標記觀察到部分共定位，應該是因為本試劑所標記的蛋白通過Golgi體運輸從ER轉移至分泌路徑。此外，添加ER-Golgi運輸抑制劑的話，會減少與高爾基體的共定位（詳細請參考原著論文）。

◆應用實例

通過蛋白組學全面分析回收蛋白

使用ERM (100 nM)處理HeLa細胞后，破碎細胞制備細胞裂解液。在裂解液中加入標簽捕獲抗體，使用Protein A磁珠進行免疫沉淀回收標記蛋白。將回收的蛋白通過SDS-PAGE分離后，切出每個條帶，在凝膠中用胰蛋白酶/ Lys-C消化制備LC/MS樣品。通過MS分析鑒定出共146種蛋白，其中63種蛋白是數(shù)據(jù)庫上的ER蛋白，或是個別論文中確認了ER駐留的蛋白。73種蛋白作為細胞膜、細胞外分泌蛋白以及高爾基體蛋白被鑒定出來，它們都是存在于細胞外分泌路徑的蛋白。由于存在于細胞外分泌途徑的蛋白會途經ER，當這些蛋白在ER的時候便會被標記。因此，檢測出來的蛋白中ER蛋白與途經ER的蛋白約占93%。本實驗中檢測出與ER無關的蛋白有10種，約占7%。

R應激引起的ER駐留蛋白變動量的定量評價

通過SILAC定量分析法分析ER應激誘導的ER駐留蛋白的變動量。準備兩份細胞，一份在SILAC Heavy標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另一份在Light標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在Heavy標記培養(yǎng)基的細胞中添加ER應激誘導試劑Tunicamycin培養(yǎng)4 h。而Light標記培養(yǎng)基無需任何處理培養(yǎng)4 h。之后，使用ERM（100 nM）處理1 h，分別制備細胞裂解液，再以1:1的比例混合。通過免疫沉淀法回收混合裂解液中的標記蛋白，然后與上述實驗一樣，制備LC/MS用樣品。檢測出了87種可相對定量的蛋白，再通過SILAC法算出由ER應激引起的變動量。其中6種蛋白因ER應激在ER上的存在量增加了兩倍以上。

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