Alpha-Fetoprotein Lens Culinaris Agglutiin-3 ELISA

二、檢測原理

三、性能指標(biāo)

1. 檢測范圍：一般為 0.625 - 40ng/ml，在此濃度區(qū)間內(nèi)，試劑盒能夠較為準(zhǔn)確地對樣本中的 AFP - L3 進(jìn)行定量檢測 。不同廠家生產(chǎn)的試劑盒，其檢測范圍可能會存在一定差異，在實(shí)際使用時，應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作 。

2. 靈敏度：通常小于 0.25ng/ml，部分優(yōu)質(zhì)試劑盒的靈敏度可達(dá)到 0.236ng/ml 或 0.239ng/ml 等 。靈敏度反映了試劑盒能夠檢測到的zui低 AFP - L3 濃度，靈敏度越高，越能檢測出樣本中極微量的 AFP - L3，對于疾病的早期診斷具有重要意義 。

3. 特異性：試劑盒對 AFP - L3 具有出色的特異性，與 AFP - L3 的類似物，如 AFP 的其他糖基化異構(gòu)體（L1、L2 等），以及其他結(jié)構(gòu)相似的蛋白等，無顯著交叉反應(yīng)或干擾 。這保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免了因其他物質(zhì)的干擾而導(dǎo)致的假陽性或假陰性結(jié)果 。

4. 精密度：包括批內(nèi)精密度和批間精密度 。批內(nèi)變異系數(shù)（CV）一般小于 10%，批間變異系數(shù)小于 12% 。精密度體現(xiàn)了試劑盒檢測結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性，變異系數(shù)越小，說明在相同條件下多次檢測的結(jié)果越接近，檢測結(jié)果越可靠 。例如，某品牌試劑盒的批內(nèi) CV 小于 7.9%（n = 20），批間 CV 小于 9.2%（n = 20） 。

四、試劑盒組成

1. 預(yù)包被 96 孔板：包被有特異性抗 AFP - L3 抗體，是檢測反應(yīng)的固相載體 ?？装逋ǔＳ筛哔|(zhì)量的聚苯乙烯等材料制成，具有良好的吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠保證抗體牢固地結(jié)合在孔壁上，且不影響抗體的活性和特異性 。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：一般為一系列已知濃度的 AFP - L3 凍干品，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性對檢測結(jié)果的定量精度至關(guān)重要，在使用前需按照說明書要求進(jìn)行復(fù)溶和稀釋 。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，以獲得不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，確保標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠覆蓋試劑盒的檢測范圍 。

4. 洗滌液：多為濃縮液，使用時需按照規(guī)定比例用蒸餾水稀釋 。其作用是在檢測過程中，去除未結(jié)合的抗原、抗體、酶標(biāo)物等雜質(zhì)，降低背景信號，提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性 。

5. 檢測試劑 A：通常為生wu素偶聯(lián)的抗 AFP - L3 抗體，可與樣本中的 AFP - L3 結(jié)合，并進(jìn)一步與后續(xù)加入的 HRP 偶聯(lián)試劑反應(yīng) 。

6. 檢測試劑 B：一般是 HRP 偶聯(lián)試劑，能夠與檢測試劑 A - AFP - L3 復(fù)合物相結(jié)合，催化 TMB 底物顯色 。

7. 稀釋液 A 和稀釋液 B：分別用于稀釋檢測試劑 A 和檢測試劑 B，以保證試劑在使用時的濃度和活性適宜 。

8. TMB 底物：作為 HRP 的底物，在 HRP 的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)，是檢測結(jié)果可視化的關(guān)鍵試劑 。TMB 底物應(yīng)避光保存，且在有效期內(nèi)使用，以確保顯色效果的穩(wěn)定性 。

9. 終止液：一般為酸性溶液，如硫酸溶液等，用于終止 TMB 的顯色反應(yīng)，使反應(yīng)體系的顏色穩(wěn)定下來，便于在酶標(biāo)儀上進(jìn)行準(zhǔn)確的吸光度測定 。

10. 封板膜：用于在孵育過程中密封微孔板，防止溶液蒸發(fā)、外界雜質(zhì)污染以及交叉反應(yīng)的發(fā)生，保證檢測反應(yīng)在相對封閉、穩(wěn)定的環(huán)境中進(jìn)行 。

五、樣本要求

1. 血清：采集靜脈血后，室溫下讓血液自然凝固 10 - 20 分鐘，然后以 2000 - 3000 轉(zhuǎn) / 分的速度離心 20 分鐘左右 。小心收集上清液，在保存過程中若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心，取上清進(jìn)行檢測 。血清樣本應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞破裂釋放的血紅蛋白等物質(zhì)可能會干擾檢測結(jié)果 。

2. 血漿：可根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉等作為抗凝劑 。采血后，將血液與抗凝劑充分混合 10 - 20 分鐘，隨后以 2000 - 3000 轉(zhuǎn) / 分的速度離心 20 分鐘左右 。收集上清液，若保存過程中有沉淀形成，需再次離心 。血漿樣本應(yīng)注意抗凝劑的種類和使用量，不同抗凝劑可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定影響 。

3. 其他生物體液：如尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等 。尿液需用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000 - 3000 轉(zhuǎn) / 分），收集上清；胸腹水、腦脊液等的處理方式與尿液類似 。細(xì)胞培養(yǎng)上清在檢測分泌性成份時，用無菌管收集后離心取上清；檢測細(xì)胞內(nèi)成份時，需先用 PBS（PH7.2 - 7.4）稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬 /ml 左右，通過反復(fù)凍融使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)成份，再離心收集上清 。若保存過程中有沉淀形成，均需再次離心 。

六、操作步驟

1. 準(zhǔn)備工作：從冰箱中取出試劑盒，在室溫下平衡 15 - 30 分鐘，使試劑盒各組分溫度與室溫一致 。同時，將所需的實(shí)驗(yàn)器材，如移液器、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、37℃孵育箱等準(zhǔn)備就緒，并確保移液器的準(zhǔn)確性 。將濃縮洗滌液按照說明書要求用蒸餾水稀釋，配制好洗滌工作液 。

2. 設(shè)置反應(yīng)孔：在預(yù)包被的 96 孔板上，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、測試樣本孔和空白對照孔 。建議對每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣本進(jìn)行至少雙孔檢測，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性 。

3. 加樣：

• 標(biāo)準(zhǔn)品加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照說明書要求進(jìn)行倍比稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 。然后，分別吸取 100μl 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品孔中 。

• 樣本加樣：將待測樣本用樣本xi釋液進(jìn)行適當(dāng)稀釋（具體稀釋倍數(shù)參照說明書），吸取 100μl 稀釋后的樣本加入到樣本孔中 。加樣時，移液器吸頭應(yīng)盡量接近孔底，但避免接觸孔壁，加樣后輕輕振蕩微孔板，使樣本與孔內(nèi)試劑充分混合 。

• 空白對照孔加樣：向空白對照孔中加入 100μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為檢測的空白對照 。

4. 孵育：加樣完成后，用封板膜密封微孔板，將其放入 37℃孵育箱中孵育 1 小時，使樣本中的 AFP - L3 與包被抗體充分結(jié)合 。

5. 洗滌：孵育結(jié)束后，小心揭掉封板膜，倒掉微孔板中的液體，用洗滌工作液進(jìn)行洗滌 。通常洗滌 3 - 5 次，每次每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后倒掉，最后一次洗滌后，將微孔板倒扣在吸水紙上，拍干板內(nèi)殘留液體，以去除未結(jié)合的物質(zhì) 。

6. 加檢測試劑 A：向每孔中加入 100μl 檢測試劑 A（生wu素偶聯(lián)的抗 AFP - L3 抗體），加樣后再次用封板膜密封微孔板，放入 37℃孵育箱中孵育 1 小時，使檢測試劑 A 與結(jié)合在包被抗體上的 AFP - L3 充分結(jié)合 。

7. 再次洗滌：同步驟 5 的洗滌操作，用洗滌工作液充分洗滌微孔板 3 - 5 次，去除未結(jié)合的檢測試劑 A 。

8. 加檢測試劑 B：向每孔中加入 100μl 檢測試劑 B（HRP 偶聯(lián)試劑），密封微孔板后，在 37℃孵育箱中孵育 30 分鐘，使 HRP 偶聯(lián)試劑與已結(jié)合的 AFP - L3 - 檢測試劑 A 復(fù)合物相結(jié)合 。

9. 第三次洗滌：重復(fù)洗滌步驟，用洗滌工作液洗滌微孔板 5 次，che底去除未結(jié)合的檢測試劑 B 。

10. 顯色：向每孔中加入 90μl TMB 底物，輕輕振蕩微孔板，使底物與孔內(nèi)的 HRP 充分接觸反應(yīng) 。將微孔板放入 37℃孵育箱中避光顯色 10 - 20 分鐘，在此期間，TMB 在 HRP 的催化下逐漸顯色，溶液顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色 。

11. 終止反應(yīng)：當(dāng)顯色達(dá)到適當(dāng)程度（可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色變化進(jìn)行判斷）時，向每孔中加入 50μl 終止液，終止 TMB 的顯色反應(yīng) 。此時，溶液顏色由藍(lán)色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。

12. 測定吸光度：終止反應(yīng)后，立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測定各孔的吸光度（OD 值） 。測定時，應(yīng)先將酶標(biāo)儀預(yù)熱，并進(jìn)行空白校準(zhǔn)，然后依次測定標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白對照孔的 OD 值 。

七、結(jié)果計算與分析

1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的平均 OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。也可使用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，如 Excel 等，通過線性回歸分析生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程 。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R 值）通常應(yīng)大于 0.95，若 R 值過低，可能需要重新檢查實(shí)驗(yàn)操作、標(biāo)準(zhǔn)品配制等環(huán)節(jié)，或重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 。

2. 計算樣本濃度：根據(jù)樣本孔的平均 OD 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的濃度值，或代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計算出樣本中 AFP - L3 的濃度 。由于樣本在檢測前可能進(jìn)行了稀釋，因此計算得到的濃度值需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，才是樣本實(shí)際的 AFP - L3 濃度 。

3. 結(jié)果分析：將計算得到的樣本 AFP - L3 濃度與正常參考范圍進(jìn)行比較 。正常參考范圍會因試劑盒的不同、檢測人群的差異（如年齡、性別、種族等）以及檢測方法的不同而有所不同，具體應(yīng)以試劑盒說明書中提供的參考范圍為準(zhǔn) 。若樣本濃度超出正常參考范圍，可能提示存在相關(guān)疾病，如肝癌等，但還需結(jié)合臨床癥狀、其他檢查結(jié)果等進(jìn)行綜合判斷 。同時，對于檢測結(jié)果異常的樣本，必要時可進(jìn)行重復(fù)檢測，以確保結(jié)果的可靠性 。

八、注意事項

1. 試劑盒保存：未開封的試劑盒應(yīng)按照說明書要求的溫度保存，一般為 2 - 8℃或 - 20℃ 。不同廠家試劑盒的保存條件可能有所不同，需嚴(yán)格遵守 。已開封的試劑盒，各組分應(yīng)分別妥善保存，避免交叉污染 。其中，標(biāo)準(zhǔn)品若為凍干品，復(fù)溶后應(yīng)盡快使用，剩余部分可分裝保存于 - 20℃，避免反復(fù)凍融；酶標(biāo)試劑、底物等應(yīng)在 2 - 8℃避光保存 。

2. 樣本采集與處理：嚴(yán)格按照樣本要求進(jìn)行采集，確保采集過程無污染，避免樣本溶血、脂血等情況的發(fā)生 。采集后的樣本應(yīng)及時進(jìn)行處理和檢測，若不能立即檢測，應(yīng)根據(jù)樣本類型選擇合適的保存條件，一般血清、血漿樣本可在 2 - 8℃短期保存，長期保存需置于 - 20℃或更低溫度 。在樣本處理過程中，如離心等操作，應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定的條件進(jìn)行，以保證樣本的質(zhì)量 。

3. 加樣操作：加樣過程中要使用精度高、經(jīng)過校準(zhǔn)的移液器，并經(jīng)常檢查移液器的準(zhǔn)確性 。加樣時應(yīng)避免吸頭接觸孔壁，加樣量要準(zhǔn)確，盡量控制加樣時間在 5 分鐘內(nèi)，以減少樣本間的差異 。對于樣本數(shù)量較多的情況，建議使用多通道移液器或排槍進(jìn)行加樣，可提高加樣效率和準(zhǔn)確性 。

4. 洗滌過程：洗滌是去除未結(jié)合物質(zhì)、降低背景干擾的關(guān)鍵步驟 。洗滌液的配制應(yīng)準(zhǔn)確，洗滌次數(shù)和時間應(yīng)嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行 。避免洗滌過度導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物被洗脫，影響檢測結(jié)果；同時也要確保洗滌充分，防止殘留的未結(jié)合物質(zhì)干擾檢測 。

5. 顯色反應(yīng)：TMB 底物應(yīng)避光保存，使用前應(yīng)平衡至室溫 。顯色時間和溫度對顯色效果有重要影響，需嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作 。顯色時間過短，顏色反應(yīng)不充分，可能導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低；顯色時間過長，可能會出現(xiàn)非特異性顯色，使背景加深，影響結(jié)果判斷 。加入終止液后，應(yīng)盡快測定吸光度，避免顏色繼續(xù)變化 。

6. 結(jié)果判斷：嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) 。所有樣本、洗滌液和廢棄物都應(yīng)按照生物安全相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理，避免生物污染 。對于檢測結(jié)果異常或可疑的樣本，應(yīng)結(jié)合臨床實(shí)際情況，必要時進(jìn)行進(jìn)一步的檢查和分析 。