【上海精瑞科學儀器有限公司 為 BIAseparations中國總代理  正規(guī)授權 售后無憂】一家專業(yè)提供HPLC色譜柱、GC色譜柱、SPE前處理小柱和其他實驗室常用耗材、配件的公司,同時提供各種進口標準品和各類分析儀器
歡迎咨詢：
156 0189 2007 馮女士(VX同號)
QQ：3295336257

 -BIA Separations！讓病毒純化更高效

前面 blabla 說了那么多，然而純化才是本工藝的精華所在。
 

BIA Separations 的二步純化工藝的穩(wěn)健性、連貫性、時效性，均堪稱教科書式的經(jīng)典。
 

首先純化的柱子，通過弱陰離子交換，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA；
 

第二步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟，進一步從超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。
 

兩步純化的作用功能明確、互相合作，大大節(jié)省操作步驟和時間。

???????   AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。

???????   在弱陰離子交換柱上捕獲質粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質，樣品結合需要低電導率，通過稀釋實現(xiàn)。 

???????   隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA，然后洗脫質粒 DNA。

層析條件
 

*1 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法
 

1.  用去離子水稀釋細菌裂解物至電導率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度。

2.  將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進行過濾。

3.  將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  將澄清的稀釋細菌裂解液進行上樣。

5.  用 20 CV 的緩沖液 A1 對色譜柱進行流洗。

6.  用 20 CV 的緩沖液 A2 對色譜柱進行流洗。

7.  用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質粒 DNA 洗脫曲線

???????    在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟，進一步從        超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。

??????? ???????   為了富集質粒 DNA 的超螺旋亞型，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上。 

??????? ???????   該步驟進一步去除了雜質。

層析條件

*2 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法

1.  調(diào)節(jié)來自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的緩沖液 B0 來平衡 C4 HLD 柱。

3.  將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。

4.  用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。

5.  用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。

7.  加樣 3 次后，對柱子進行清洗。

圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質粒 DNA

·  從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋 pDNA 組份含有硫酸銨，必須在生物應用質粒之前將其除去。

·  緩沖液交換可通過透析濾過或體積排除色譜等方法進行。

·  配置和填充可能需要額外的處理。
 

二步法層析過程分析：

???????    質粒 DNA 制造成功的關鍵是實時過程控制方法，確保最終產(chǎn)品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

??????????   CIMac™pDNA 分析柱可用于監(jiān)測降解產(chǎn)物（開環(huán)和線性 pDNA），去除雜質（RNA），并確保每個生產(chǎn)步驟都能產(chǎn)生預期的超螺旋 pDNA 量。

???????   ???????CIMac™pDNA 分析柱還用于超螺旋質粒 DNA 含量的質量控制。

圖 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的質粒 DNA 亞型含量的質量控制

結果和結論：
 

??????? ?????  通過優(yōu)化裂解、沉淀和兩種色譜步驟相結合，可生產(chǎn)滿足所有監(jiān)管要求的純 pDNA。

??????? ???????  可以完成去除 99% 以上的主要雜質（RNA，基因組 DNA，宿主細胞蛋白，內(nèi)毒素和開環(huán) pDNA）。

??????? ???????  此外，快速（大腸桿菌的 pDNA 提取和純化可在幾小時內(nèi)完成），可重復的過程可降低運營成本并提高工廠生產(chǎn)率。 

??????? ???????  *的整體特性有助于該過程的直接可擴展性，涵蓋從小規(guī)模實驗室到大規(guī)模工業(yè)純化 pDNA 的生產(chǎn)水平。

Table 1: Process results.

點評 
 

目前市面上有不少質粒純化工藝方案，但是比較下來，BIA 二步法純化工藝具有兩大優(yōu)勢：
 

???????  效率明顯提高

只需兩步色譜和高流速的整體柱色譜方案，減少工藝步驟（提高回收率）并加快純化速度，從而顯著提高生產(chǎn)率。
 

???????   靈活放大

由于特定的整體柱設計，質粒 DNA 過程可以快速擴展到更大的單位。 

在 1 毫升色譜柱上設計的工藝可以輕松轉移到試驗和生產(chǎn)規(guī)模。

在 8L 色譜柱上單次運行可以產(chǎn)生 48 g 藥物級 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

十多年來，BIA Separations 一直是高效率質粒純化的好選擇。它不僅提供整體柱和平臺模板，還提供定制的純化服務，以*您的質粒 DNA 純化需求

159 0176 2218（VX同號）