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化工儀器網(wǎng)>產(chǎn)品展廳>配件耗材>色譜配件>液相色譜柱>100.0011-2 AAV 質粒下游純化 GMP整體預裝柱大通量

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100.0011-2 AAV 質粒下游純化 GMP整體預裝柱大通量

具體成交價以合同協(xié)議為準
  • 公司名稱 上海精瑞科學儀器有限公司
  • 品牌 其他品牌
  • 型號 100.0011-2
  • 產(chǎn)地
  • 廠商性質 代理商
  • 更新時間 2024/12/18 19:41:35
  • 訪問次數(shù) 1128

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 上海精瑞科學儀器有限公司,總部設在高校云集、學術氣氛濃郁的上海徐匯區(qū),位處徐家匯-上海體育館繁華商圈,是國內(nèi)色譜分析領域專業(yè)的色譜耗材供應商,色譜耗材專家!有近10萬種產(chǎn)品,同進提供免費色譜柱篩選服務。       

 

       精瑞科學的專業(yè)及誠信贏得了ThermoFisher、Supelco、Merck、Sigma、BIA Separations等授權的一級代理。


 我們服務于醫(yī)藥研發(fā)、生命科學、食品安全、農(nóng)藥、獸藥、環(huán)境、工業(yè)品等檢測領域,與眾多制藥公司、食品企業(yè)、政府檢測機構、高??蒲袡C構及第三方檢測機構都有密切的合作關系

 

離子色譜耗材,液相色譜耗材,sigma耗材配件,supelco配件耗材

供貨周期 現(xiàn)貨 貨號 100.0011-2
應用領域 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保

上海精瑞科學儀器有限公司  BIAseparations中國總代理  正規(guī)授權 售后無憂】一家專業(yè)提供HPLC色譜柱、GC色譜柱、SPE前處理小柱和其他實驗室常用耗材、配件的公司,同時提供各種進口標準品和各類分析儀器
歡迎咨詢:
156 0189 2007 馮女士(VX同號)
QQ3295336257

 -BIA Separations!讓病毒純化更高效

 

前面 blabla 說了那么多,然而純化才是本工藝的精華所在。
 

BIA Separations 的二步純化工藝的穩(wěn)健性、連貫性、時效性,均堪稱教科書式的經(jīng)典。
 

首先純化的柱子,通過弱陰離子交換,濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA;
 

第二步利用疏水相互作用色譜(HIC)的拋光步驟,進一步從超螺旋(SC)治療級 pDNA 中除去開環(huán)(OC)和線性 pDNA 亞型。
 

兩步純化的作用功能明確、互相合作,大大節(jié)省操作步驟和時間。



 

???????   AEX 色譜柱(CIMmultus™DEAE)濃縮 pDNA,并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。

???????   在弱陰離子交換柱上捕獲質粒 DNA,其中除去剩余的 RNA 和蛋白質,樣品結合需要低電導率,通過稀釋實現(xiàn)。 

???????   隨著增加 NaCl 的梯度洗脫,首先洗脫 RNA,然后洗脫質粒 DNA。

 

層析條件
 

Monolithic column:

CIMmultus™  DEAE(2 µm)*1

phase:

Equilibration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA,   pH 7.2

 

Washing buffer  A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M   NaCl, pH 7.2

 

Elution buffer  A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M   NaCl, pH 7.2

Working flow rates:

0.5 – 5 column volume (CV) /min (具體取決于樣品特性,使用的層析設備和色譜柱尺寸)

*1 選擇色譜柱體積,取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法
 

1.  用去離子水稀釋細菌裂解物至電導率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度。

2.  將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進行過濾。

3.  將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  將澄清的稀釋細菌裂解液進行上樣。

5.  用 20 CV 的緩沖液 A1 對色譜柱進行流洗。

6.  用 20 CV 的緩沖液 A2 對色譜柱進行流洗。

7.  用 20 CV 的緩沖液 A3(以半工作流速)洗脫并收集 pDNA。


圖 1:AEX CIMmultus™DEAE(2μm)柱上的質粒 DNA 洗脫曲線



 

???????    在高配體密度丁基修飾的(CIMmultus TM C4 HLD)整體柱上,利用疏水相互作用色譜柱(HIC)的拋光步驟,進一步從        超螺旋(SC)治療級 pDNA 中除去開環(huán)(OC)和線性 pDNA 亞型。

??????? ???????   為了富集質粒 DNA 的超螺旋亞型,將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱(C4 HLD)上。 

??????? ???????   該步驟進一步去除了雜質。

 

層析條件

 

phase:

Equilibration  buffer B0:   50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M   (NH4)2SO4, pH 7.2

 

Washing  buffer  B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7  M (NH4)2SO4, pH 7.2

 

Adjustment  buffer: 4 M (NH4)2SO4

 

Elution  buffer  B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4  M (NH4)2SO4 , pH 7.2

 

Regeneration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2

Working flow  rates:

0.5 – 5 CV/min (具體取決于樣品特性、使用的層析設備和色譜柱尺寸)

*2 選擇色譜柱體積,取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法

 

1.  調(diào)節(jié)來自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液,每 1 體積(V)洗脫液加入 3 體積(V)的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的緩沖液 B0 來平衡 C4 HLD 柱。

3.  將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。

4.  用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。

5.  用緩沖液 B2(以半工作流速)洗脫并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。

7.  加樣 3 次后,對柱子進行清洗。


圖 2:在 HIC CIMmultus TM C4 HLD(2μm)柱上分離超螺旋質粒 DNA



 

·  從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋 pDNA 組份含有硫酸銨,必須在生物應用質粒之前將其除去。

·  緩沖液交換可通過透析濾過或體積排除色譜等方法進行。

·  配置和填充可能需要額外的處理。
 

二步法層析過程分析:

 

???????    質粒 DNA 制造成功的關鍵是實時過程控制方法,確保最終產(chǎn)品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

??????????   CIMac™pDNA 分析柱可用于監(jiān)測降解產(chǎn)物(開環(huán)和線性 pDNA),去除雜質(RNA),并確保每個生產(chǎn)步驟都能產(chǎn)生預期的超螺旋 pDNA 量。

???????   ???????CIMac™pDNA 分析柱還用于超螺旋質粒 DNA 含量的質量控制。


圖 3:使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的質粒 DNA 亞型含量的質量控制

 

結果和結論:
 

??????? ?????  通過優(yōu)化裂解、沉淀和兩種色譜步驟相結合,可生產(chǎn)滿足所有監(jiān)管要求的純 pDNA。

??????? ???????  可以完成去除 99% 以上的主要雜質(RNA,基因組 DNA,宿主細胞蛋白,內(nèi)毒素和開環(huán) pDNA)。

??????? ???????  此外,快速(大腸桿菌的 pDNA 提取和純化可在幾小時內(nèi)完成),可重復的過程可降低運營成本并提高工廠生產(chǎn)率。 

??????? ???????  *的整體特性有助于該過程的直接可擴展性,涵蓋從小規(guī)模實驗室到大規(guī)模工業(yè)純化 pDNA 的生產(chǎn)水平。

Table 1: Process results.

 

Process  yield

>  80 %

A260/280

1.92

Homogeneity  (SC pDNA)

>  97 %

HCD  – removed

>  99.5 %

HCP  - removed

>  99 %

Endotoxin

<  2 EU/mg pDNA

RNA  - removed

>  99 %

 

點評 
 

目前市面上有不少質粒純化工藝方案,但是比較下來,BIA 二步法純化工藝具有兩大優(yōu)勢:
 

???????  效率明顯提高

只需兩步色譜和高流速的整體柱色譜方案,減少工藝步驟(提高回收率)并加快純化速度,從而顯著提高生產(chǎn)率。
 

???????   靈活放大

由于特定的整體柱設計,質粒 DNA 過程可以快速擴展到更大的單位。 

在 1 毫升色譜柱上設計的工藝可以輕松轉移到試驗和生產(chǎn)規(guī)模。

在 8L 色譜柱上單次運行可以產(chǎn)生 48 g 藥物級 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

 

Column size

pDNA  purified per cycle

1  mL

6  mg

8  mL

48  mg

80  mL

480  mg

800  ml

4.8  g

8000  mL

48  g

 

十多年來,BIA Separations 一直是高效率質粒純化的好選擇。它不僅提供整體柱和平臺模板,還提供定制的純化服務,以*您的質粒 DNA 純化需求

159 0176 2218(VX同號)

 

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