0827775 干細胞 類器官用基質(zhì)膠推薦的應(yīng)用：

干細胞培養(yǎng)，如hESC,iPSC,提供人胚胎干細胞和誘導多功能性干細胞無滋養(yǎng)層培養(yǎng)所需的可重復性和一致性。

產(chǎn)品貨號：0827775

中文名稱：ABW基質(zhì)膠  干細胞

產(chǎn)品規(guī)格：5ml

產(chǎn)品品牌：ABW

0827775 干細胞 類器官用基質(zhì)膠可運用領(lǐng)域：

1.類器官培養(yǎng)  2.血管生成實驗  3.細胞侵襲實驗，Transwell實驗    4.PDX，CDX模型實驗  5.愿為腫瘤移植，皮下成瘤實驗  6.干細胞培養(yǎng)及細胞分化研究  7.其他待開發(fā)實驗類型

ABW® 誘導多能干細胞培養(yǎng)方案

ABW® Induced Pluripotent Stem Cell（iPSC）Culture Protocols

一、培養(yǎng)材料

1、試劑：ABW® Matrigengel（REF: 0827775）；ROCK 抑制劑（Y-27632）；DMEM F12/DMEM；mTeSR1/E8培養(yǎng)基；Accutase解離劑、PBS(D-PBS）

2、耗材：無菌槍頭；六孔板；無菌EP管。

二、培養(yǎng)準備

1、材料預冷：

a、將ABW® Matrigengel 置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化;

b、4℃預冷無菌離心管、無菌槍頭、六孔板、DMEM F12/DMEM；

2、將ABW® Matrigengel（REF: 0827775）以1：80或1：100比例進行稀釋：

a、將適量4℃的DMEM F12/DMEM移入冷卻的15/50 mL EP中;

b、使用移液器將預冷的槍頭從EP管吸取DMEM F12/DMEM中移入分裝好的ABW® Matrigengel，再吸取轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)；重復幾次，直到基質(zhì)膠*移入到EP管中。

c、按比例混合后作為儲備基質(zhì)膠混合液，進行后續(xù)鋪板；

3、制作基質(zhì)膠涂層

a、按1mL/孔將基質(zhì)膠混合液加入預冷的六孔板中，輕輕晃動以確?；旌弦壕鶆蜾佋诎迳?；

b、將6孔板轉(zhuǎn)移到37℃孵育過夜（板材可以在孵育一小時后即可使用，但過夜孵育的涂層對細胞培養(yǎng)效果更佳）；

c.使用前吸去涂層上方液體。

4、配置ROCK 抑制劑（Y-27632）工作液：使用無菌PBS將Y-27632溶解，配置成10mM溶液（1000X），工作濃度為10μM;

5、配置含ROCK抑制劑mTeSR1/E8培養(yǎng)基：將10mM溶液加入mTeSR1/E8培養(yǎng)基至終濃度為10μM。

注意：ABW® Matrigengel在>4℃時會逐漸聚合成膠，請嚴格把控操作溫度，控制操作時間；稀釋后的基質(zhì)膠混合液同樣需要冰上操作。

一、細胞培養(yǎng)

1、復蘇iPSC

a.從液氮罐或干冰中取出ipsc，37℃水域中解凍，解凍應(yīng)迅速完成；

b.用75% 酒精消毒凍存管后轉(zhuǎn)移到超凈臺/生物安全柜；

c.將細胞溶液轉(zhuǎn)移到新的15ml EP管中，用DMEM F12/DMEM沖洗凍存管兩次

d.室溫 300g 離心5min（ipsc對于200-300g的轉(zhuǎn)速都有較好的耐受性，建議使用300g來最.大限度捕捉細胞，標準程序下建議使用200g）;

e.棄上清，用2mL含有ROCK抑制劑的培養(yǎng)基輕柔地重懸iPSC后轉(zhuǎn)移到用鋪好板的孔中，前后搖動使得細胞均勻分布（建議將每瓶細胞1*10 6裝在六孔板的一個孔內(nèi)使細胞存活率最D化）

f.將六孔板放回37℃培養(yǎng)箱，（請在細胞被轉(zhuǎn)移后立即執(zhí)行，避免細胞中.央密度增加）

g.次日撤去ROCK抑制劑，即用無抑制劑的培養(yǎng)基替代含抑制劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

注意：細胞培養(yǎng)過程中不提倡使用抗生素，其會干擾細胞和其分化潛能；培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)與其他細胞隔離，兩次傳代后檢測支原體；DMSO在室溫下對細胞有毒，復蘇步驟應(yīng)快速完成

2、iPSC傳代

a.將培養(yǎng)上清吸去，用1mL的PBS清洗后加入1mL Acuutase；

b.轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱3分鐘，或在顯微鏡下觀察直到大部分細胞脫落（若細胞仍然附著，可將培養(yǎng)板放在手上，另一手輕輕在你的手上拍打使板發(fā)生輕微震動從而使細胞脫落）；

c.傳代前準備好基質(zhì)膠涂布的六孔板

d.傾斜培養(yǎng)板，將Accutase溶液沿培養(yǎng)層表面轉(zhuǎn)移兩次，分離結(jié)塊并轉(zhuǎn)移到離心管中

e.用DMEM F12/DMEM沖洗培養(yǎng)層表面，并與管中的細胞溶液合并（使用DMEM/F12或用PBS洗滌，建議使用至少5%的培養(yǎng)基，有利于隨后的造粒和附著）；

f.室溫下 300g 離心五分鐘

g.吸去上清，用含有ROCK抑制劑的培養(yǎng)基進行重懸；

h.將細胞加入到涂層板中，輕輕搖動使細胞分布均勻；

i.將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育。

注意：IPSC生長為單層后則會迅速分化并死亡，為了保持生長和多能性，需在其長滿前進行傳代。

3、iPSC細胞凍存

a.準備細胞和解離液，在解離液解離細胞過程中，將培養(yǎng)基與10%DMSO混合，在凍存管上貼好標簽，配置好凍存液（可選20%血清或血清替代物提高存活率， 也可以使用90%胎牛血清+10%DMSO）；

b.分離細胞方法同傳代，可以使用細胞計數(shù)器來配合進行細胞的凍存；

c. 以1X10^6 凍存每管細胞，之后進行離心、抽吸培養(yǎng)基，然后在適當體積的凍存液中進行重懸；

d.將1ml重懸好的細胞凍存液加到1.5ml凍存管中，并進行程序性降溫，在液氮罐中長期保存。