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TUNEL凋亡顯色法
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細(xì)胞凋亡的原理是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，DNA內(nèi)切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上帶有生物素(Biotin) 標(biāo)記的dUTP即Bitin-dUTP.,隨后于辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的streptavidin結(jié)合， 在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細(xì)胞,從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測到細(xì)胞凋亡。
實驗意義
1. TUNEL法是一種分子生物學(xué) 與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，可對完整的單個凋亡細(xì)胞或者凋亡小體進(jìn)行原位染色，可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。
2.石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡可用于石蠟切片冰凍切片培養(yǎng)的細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)方法要高。
3.操作簡便快捷，在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。
實驗步驟
1.石蠟切片TUNEL顯色法:
?、偈炃衅Ｒ?guī)脫蠟至水，脫蠟劑二甲苯，至水劑乙醇;
?、赑BS漂洗3*5 min; .
③加入蛋白酶K工作液37°C反應(yīng)15-30 min, PBS漂洗3x5 min;
?、?%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室溫固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;
⑤浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;
?、藜尤脒m量TdT酶反應(yīng)液，暗濕盒中37°C反應(yīng)1 h,用SSC室溫15 min終止反應(yīng)后,PBS漂洗3x5 min; .
?、呓?.3% H202封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;
?、嗟渭覵treptavidin-HRP工作液，37*C反應(yīng)30-60 min, PBS漂洗3x5 min;
?、岬渭覦AB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次;
10.選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核;
脫水、透明、中性樹膠封片后進(jìn)行觀察。
2.冰凍切片TUNEL顯色法:
?、傩迈r組織經(jīng)處理后，立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片，厚度為5~6 um;
?、诜烂摬Ｆ?，貼片，室溫陰干約12 h;
?、?%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室溫固定10 min, PBS漂洗3x5 min;
?、芙敕忾]液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;
?、萁脒兺敢?0.1% Triton X-100溶于PBS中)，室溫通透30 S-2 min;
?、藜尤脒m量TdT酶反應(yīng)液，暗濕盒中37°C反應(yīng)1 h,用SSC室溫15 min終止反應(yīng)后，PBS漂洗3x5 min; .
?、呓?.3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;
?、嗟渭覵treptavidin-HRP工作液，379C反應(yīng)30-60 min, PBS漂洗3x5 min;
?、岬渭覦AB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次:
@選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核;
脫水、透明、中性樹膠封片后進(jìn)行觀察。
石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡實驗完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn)
1.實驗周期: 1-2周
2.交付標(biāo)準(zhǔn):蠟塊、切片、染色圖片.實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等)
需確認(rèn)的信息
1.樣本的種屬.
2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)
3.是否提供試劑盒
4.拍照要求
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)服務(wù)周期提供結(jié)果:
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