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細(xì)菌轉(zhuǎn)座子突變體文庫構(gòu)建介紹
參考價(jià) | ¥ 1000 |
訂貨量 | ≥100uL |
- 公司名稱 武漢銳志魔方生物科技有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號(hào)
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 經(jīng)銷商
- 更新時(shí)間 2023/5/30 17:22:10
- 訪問次數(shù) 262
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突變體庫構(gòu)建, 銅綠假單胞菌PAO1,PAK 大腸桿菌ATCC25922 肺克ATCC700603 幽門螺桿菌ATCC26695,ATCC43504,SS1 金黃色葡萄球菌 ATCC29213,ATCC25923,USA300 枯草芽孢桿菌168 變形鏈球菌UA159 乳酸乳球菌 NZ9000
細(xì)菌轉(zhuǎn)座子突變體文庫構(gòu)建介紹
轉(zhuǎn)座子(transposon)是一類可以自主位移并插入宿主基因組中隨機(jī)位點(diǎn)的移動(dòng)遺傳因子,這種轉(zhuǎn)位特性使它可以直接或間接地造成基因重排,引起基因變異。
隨著許多微生物基因組全序列的獲得,人們對(duì)微生物關(guān)注和研究的熱點(diǎn)已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué),在大量的分子遺傳研究方法中,轉(zhuǎn)座子隨機(jī)誘變技術(shù)因操作簡(jiǎn)便易行而備受關(guān)注。
該方法是將轉(zhuǎn)座子引入細(xì)菌染色體中,隨機(jī)插入誘變某些基因得到大量的突變株,從中篩選感興趣表型的突變株,進(jìn)而研究與該表型相關(guān)的被失活基因的功能?,F(xiàn)在轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)已經(jīng)成為微生物分子遺傳學(xué)研究的有力工具之一,轉(zhuǎn)座子及其衍生物作為插入突變?cè)蚍肿訕?biāo)簽已被廣泛地應(yīng)用于基因的分離和克隆當(dāng)中,特別是某些具有隨機(jī)轉(zhuǎn)座特性的轉(zhuǎn)座子,已成為發(fā)現(xiàn)新基因、克隆功能基因、發(fā)掘己知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具。
構(gòu)建細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫是從基因組水平篩選毒力相關(guān)基因、生物被膜相關(guān)基因等與特定表型相關(guān)基因的一種重要手段。我們做過銅單胞菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、幽門螺旋桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形鏈球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌等細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子突變體構(gòu)建,具有豐富的構(gòu)建經(jīng)驗(yàn),下面給大家簡(jiǎn)單介紹一下我們做過的轉(zhuǎn)座子突變體文庫構(gòu)建大概過程,供相關(guān)科研工作者參考。
1. 菌株選擇
一般可以做標(biāo)準(zhǔn)菌株也可以做自己篩選分離的特殊菌株。主要還是看我們想研究的客戶目的。比如我們?cè)谕寥乐谢蛘哐褐蟹蛛x出來一種抗性非常強(qiáng)的菌株,那么我們也是可以對(duì)此菌株進(jìn)行突變體文庫構(gòu)建,進(jìn)一步去篩選相關(guān)耐藥基因和耐藥機(jī)制的。由于構(gòu)建出來的突變體庫數(shù)量多,因此此文庫比較適合專門針對(duì)某種細(xì)菌研究的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行構(gòu)建研究。
2. 提前準(zhǔn)備:
(1)菌株全基因組測(cè)序數(shù)據(jù):為后續(xù)突變株插入位點(diǎn)驗(yàn)證分析提供數(shù)據(jù)參考;
(2)抗性分析:確定對(duì)哪些抗生素敏感,從而為載體構(gòu)建時(shí)的抗生素選擇提供參考。
3. 載體選擇和構(gòu)建
Tn917、Tn10 及 mariner 類家族轉(zhuǎn)座元件是目前在芽孢桿菌中應(yīng)用比較廣泛的 3 類轉(zhuǎn)座子,而且都已被改造并成功應(yīng)用于變體庫的構(gòu)建及基因功能的研究中,特別是芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)座頻率高,但各具有不同的轉(zhuǎn)座特點(diǎn),其中 mariner 類家族轉(zhuǎn)座元件更具優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
轉(zhuǎn)座子 Tn917 是一種鏈球菌 Tn3 類似轉(zhuǎn)座子,被構(gòu)建于溫敏復(fù)制質(zhì)粒載體如 pTV1[1](圖1)【5】、pTV1Ts及具有葡萄球菌復(fù)制子 pE194、pE194Ts 的衍生質(zhì)粒上[8]。Tn917 長(zhǎng)度為 5.4 kb,攜帶可誘導(dǎo)的紅霉抗性基因,含有與 Tn3 家族轉(zhuǎn)座子類似的末端重復(fù)序列,并且 Tn917 的轉(zhuǎn)座酶與 Tn3 的轉(zhuǎn)座酶有 80%的相似性。
轉(zhuǎn)座子 Tn10 是繼轉(zhuǎn)座子 Tn917 之后,被應(yīng)用于轉(zhuǎn)座誘變的另一個(gè)很好的選擇。Tn10 是一種鼠傷寒沙氏菌 Salmonella typhimurium 轉(zhuǎn)座子。它是具有多種抗生素抗性標(biāo)記質(zhì)粒 R100.1 的一個(gè)組成部分,長(zhǎng)度為 9300 bp,由兩端長(zhǎng) 1329 bp 的末端反向重復(fù)序列 IS10 及位于兩端 IS10 之間的長(zhǎng) 6700 bp 的四環(huán)素抗性基因組成。其中,四環(huán)素抗性基因 tetR 來自一種從噬菌體P22 中獲得的 R 因子。Tn10 可在鼠傷寒沙菌及大腸桿菌染色體上發(fā)生不依賴寄主重組系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座,并且能夠轉(zhuǎn)座插入到沙氏菌染色體的多個(gè)不同位點(diǎn)上。Mariner 轉(zhuǎn)座元件是一種 簡(jiǎn)單的真核轉(zhuǎn)座子,與其他轉(zhuǎn)座子相比,mariner 轉(zhuǎn)座元件具有插入位點(diǎn)隨機(jī)性高,以及與品種特定的寄主因素?zé)o關(guān)、可以在不同品種間水平轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)Mariner 及其類似轉(zhuǎn)座元件被稱作 MLEs(Mariner-like elements)Mariner 家族轉(zhuǎn)座元件 活躍、研究 成熟的兩種轉(zhuǎn)座元件是 Himar1 和 Mos1 轉(zhuǎn)座元件。Himar1 轉(zhuǎn)座元件是從西方角蠅中分離得到的[4],是在細(xì)菌誘變中應(yīng)用 廣泛的 mariner 家族轉(zhuǎn)座子。Mos1 轉(zhuǎn)座元件來自黑腹果蠅,是 mariner 家族在真核生物應(yīng)用中 高效的轉(zhuǎn)座元件。
4. 轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)化和突變體庫構(gòu)建和表型篩選鑒定
5. 技術(shù)應(yīng)用
轉(zhuǎn)座子及其衍生物作為插入突變工具或分子標(biāo)簽已被廣泛地應(yīng)用于基因的分離和克隆之中,特別是某些具有隨機(jī)轉(zhuǎn)座特性的轉(zhuǎn)座子,已成為發(fā)現(xiàn)新基因、克隆功能基因、發(fā)掘已知基因的功能以及研究蛋白功能的有效工具。
6、參考文獻(xiàn)
【1】Rhodes K A , Ma M C , María A.Rendón, et al. Neisseria genes required for persistence identified via in vivo screening of a transposon mutant library[J]. PLoS pathogens, 2022, 18(5):e1010497.
【2】Poulsen B E , Rui Y , Clatworthy A E , et al. Defining the core essential genome of Pseudomonas aeruginosa[J]. Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(20).
【3】Rajagopal M , Martin M J , Santiago M , et al. Multidrug Intrinsic Resistance Factors in Staphylococcus aureus Identified by Profiling Fitness within High-Diversity Transposon Libraries[J]. mBio, 2016, 7(4):e00950-16
【4】Mike L A , Stark A J , Forsyth V S , et al. A systematic analysis of hypermucoviscosity and capsule reveals distinct and overlapping genes that impact Klebsiella pneumoniae fitness[J]. PLoS Pathogens, 2021, 17(3):e1009376.
【5】馬欣, 高學(xué)文. 轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變芽孢桿菌的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2015(3):10.