今天，我們來看看，在進(jìn)行核酸優(yōu)化時，為什么選擇整體柱要優(yōu)于傳統(tǒng)的多孔顆粒填充柱？。先放一個制作的整體柱純化核酸的原理動畫，形象生動，易于理解，這篇文章中許多關(guān)鍵的點(diǎn)，在動畫中均有描繪。如果看完動畫，沒有興趣，那沒必要再看下面的文字，因?yàn)槲恼绿L，費(fèi)時費(fèi)力

=多孔顆粒填充柱和整體柱

擴(kuò)散和對流基本概念

多孔介質(zhì)中的擴(kuò)散傳質(zhì)

在色譜中，固定相和流動相之間的距離非常小，納米級到微米級，但是對于依靠擴(kuò)散的方式來實(shí)現(xiàn)生物分子傳質(zhì)過程的多孔介質(zhì)來說，這樣的距離是非常大的。在裝填多孔顆粒的色譜柱中，擴(kuò)散是溶質(zhì)分子進(jìn)出顆?？讖絻?nèi)部的 方式（因?yàn)榭讖絻?nèi)部的流速為0），溶質(zhì)分子越大，擴(kuò)散就越慢，那么固定相多孔介質(zhì)的動態(tài)結(jié)合容量就越低。

此外，在多孔顆粒色譜中，對流傳質(zhì)和擴(kuò)散傳質(zhì)的相互作用也會造成固定相介質(zhì)結(jié)合容量的降低。在對流將生物大分子沖走之前，它有一個非常短的時間擴(kuò)散進(jìn)入多孔顆粒內(nèi)部。流速越快，窗口時間就會越短，溶質(zhì)來不及擴(kuò)散進(jìn)入顆?？讖絻?nèi)部，就已經(jīng)通過對流沖走了，因此顆粒的結(jié)合容量就會越低。由于生物大分子擴(kuò)散系數(shù)降低引起的色譜固相介質(zhì)結(jié)合容量的降低，可通過降低流速來彌補(bǔ)?？偨Y(jié)來說，在多孔顆粒介質(zhì)中，固定相結(jié)合容量跟流速和溶質(zhì)大小成反比。

在多孔顆粒中發(fā)生異質(zhì)性傳質(zhì)，如果流速太快，緩慢的擴(kuò)散過程無法實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)分子在顆粒孔徑內(nèi)部和顆?？障吨g的濃度平衡。

流速對于固定相介質(zhì)動態(tài)結(jié)合容量的影響。左圖：由于流速增加，擴(kuò)散傳質(zhì)效率降低，多孔介質(zhì)的結(jié)合容量隨著流速的增加而降低。右圖：整體柱中是對流傳質(zhì)，其固相介質(zhì)結(jié)合容量不受流速影響。注：此處的曲線稱為Breakthrough Curve，縱坐標(biāo)指的是由于過載而損失的蛋白占總蛋白的含量，橫坐標(biāo)指的是每ml基質(zhì)裝載的蛋白量（mg protein load/medium volume(mg/ml)）

固相介質(zhì)孔徑和結(jié)合表面積差異

大分子物質(zhì)，比如核酸，在整體柱中擁有更高的結(jié)合容量，這也同整體柱為生物大分子提供了一個更大的結(jié)合表面積有關(guān)。對于整體柱來說，內(nèi)部管道的整個表面積都是可以被溶質(zhì)分子結(jié)合的。

在多孔介質(zhì)色譜柱中，溶質(zhì)分子可以毫無障礙地接觸到顆粒外部全部的表面積，但是外部表面積只占到顆?？讖絻?nèi)部表面積的2%。只有更大的顆?？讖讲拍苋菁{更大的溶質(zhì)分子，但是，溶質(zhì)分子要毫無限制地結(jié)合到顆?？讖絻?nèi)部表面，需要顆粒的平均孔徑超過溶質(zhì)分子十倍之多。多孔介質(zhì)的孔徑超過100nm是非常罕見的，因?yàn)榭讖竭^大會降低顆粒穩(wěn)定性。

溶質(zhì)大小和顆粒孔徑大小嚴(yán)重影響介質(zhì)結(jié)合能力

質(zhì)粒DNA吸附在介質(zhì)表面

因此，從顆?？讖胶徒橘|(zhì)單位面積的結(jié)合質(zhì)量來看，整體柱更適合大分子溶質(zhì)，因?yàn)槠淇梢蕴峁└叩慕橘|(zhì)結(jié)合容量。而對于小分子（蛋白）來說，多孔介質(zhì)具有更高效的結(jié)合能力。

不同大小的溶質(zhì)分子在整體柱和多孔介質(zhì)中的結(jié)合容量差異

整體柱中的層流和多孔介質(zhì)中的湍流由于摩擦力的存在，介質(zhì)表面流速為0，越遠(yuǎn)離介質(zhì)表面，層流速度越快，引起層流彌散。

彌散是色譜分辨率的敵人。在整體柱中，僅存在微弱的層流彌散，使得其對于各種大小的溶質(zhì)分子，在各種流速下，均具有良好的色譜分辨率。相反，多孔介質(zhì)中產(chǎn)生的彌散來源更多，程度更嚴(yán)重，主要包括低效的擴(kuò)散和漩渦彌散。隨著流速的增加，溶質(zhì)分子的增大，擴(kuò)散越慢，總彌散程度越嚴(yán)重，分辨率越低。

不同介質(zhì)，不同流速，引起不同類型的彌散，從而影響色譜分辨率。整體柱的分辨率不會受到溶質(zhì)分子和流速的影響

多孔顆粒間隙產(chǎn)生的渦流剪切力

總結(jié)

整體柱被作為第4代色譜固定相，在快速分離純化生物大分子方面，與傳統(tǒng)多孔介質(zhì)相比，具有特別的優(yōu)勢，整體柱出眾的純化性能是由于內(nèi)在的特性決定的，基于對流的傳質(zhì)方式和高效的結(jié)合能力（特別是生物大分子）；與溶質(zhì)大小，流體速度無關(guān)的高分辨率；無孔徑限制的，廣泛的可結(jié)合表面積；微弱的剪切力。獲得高質(zhì)量高純度的質(zhì)粒DNA和RNA分子，對于DNA疫苗或者RNA疫苗來說，是至關(guān)重要的工藝源頭。由于巨大的質(zhì)量和直徑，開發(fā)質(zhì)粒DNA或者RNA分子純化工藝時，性能更*的整體柱時一個非常不錯的選擇。