時下火熱的10X Genomics公司Chromium解決方案無法滿足某些特殊或者少量細胞樣本甚至單細胞轉(zhuǎn)錄組研究。Smart-seq2技術在單細胞水平對帶Poly（A）的RNA進行全長轉(zhuǎn)錄組擴增及高通量測序，能夠滿足高靈敏度、低偏好性的cDNA擴增，得到全長轉(zhuǎn)錄本，實現(xiàn)高水平的序列模板轉(zhuǎn)換。

Smart-seq2技術有較好的覆蓋范圍，可檢測到稀有轉(zhuǎn)錄本，無需額外的專業(yè)設備，應用范圍較廣，可以解決傳統(tǒng)RNA 定量技術在早期胚胎發(fā)育、干細胞、癌癥、免疫等研究領域中存在的樣品量極低或細胞異質(zhì)性的問題，是在單細胞水平研究基因表達強有力的工具，極大地拓展了RNA-seq 的應用范圍。

技術優(yōu)勢：

1、起始量低：1-1000個細胞或10pg-10ng total RNA即可高效擴增；

2、檢測靈敏度高： 大幅度增加了低表達基因的檢出量;

3、堿基分辨率高： 可達單堿基分辨率，且可以定位到具體基因的具體轉(zhuǎn)錄本;

4、實驗可控： 質(zhì)控點多，可從實驗的開端判斷細胞狀況；

5、轉(zhuǎn)錄本覆蓋度高： 通過雙端引物擴增全長cDNA，獲得全轉(zhuǎn)錄組信息，避免3’端和5’端偏好性，產(chǎn)物完整性好。

實驗策略：

分析內(nèi)容：

送樣要求：

經(jīng)典案例：

Bj?rklund 等利用Smart-seq2單細胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示人CD127+先天淋巴細胞的異質(zhì)性

The heterogeneity of human CD127(+) innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing

先天淋巴細胞（ILCs）是一種免疫細胞，它通過釋放可溶性的因素調(diào)節(jié)對病毒、細菌和寄生蟲的早期免疫反應。這些細胞可以根據(jù)細胞表面的轉(zhuǎn)錄因子及細胞因子被分為三個亞型，每種亞型都有不同的功能。利用流式細胞儀分選患有阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥患者的扁桃體組織中的ILCs（Lin－CD127+）和NK cells（CD45+Lin－CD127－NKG2A+CD56+CD16－ ）。采用Smart-seq2進行單細胞轉(zhuǎn)錄組擴增建庫；Illumina HiSeq 2000 3M reads /樣本進行測序分析。采用PCA（主成分分析）和t-SNE對ILC中847個表達的基因進行分型分析，將細胞分為4類：ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。應用SCDE軟件包對4類細胞的差異基因進行分析，找出共有及差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD127+ILCs中共有的差異基因的表達量比NK細胞中明顯要高。ILC1、 ILC2、ILC3差異基因表達分析，結(jié)果表明，ILC1 cells共有79個上調(diào)表達基因，參與干擾素γ的調(diào)控，ILC2 cells共有58個上調(diào)表達的基因，在前列腺素、Notch信號通路及環(huán)境感應中發(fā)揮作用，ILC3 cells共有371個上調(diào)表達的基因，根據(jù)GO注釋有85個與免疫相關，且存在未知功能的基因。

采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958個注釋的免疫基因，將ILC3分為3個亞型：Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通過對這3種亞型細胞的分析，發(fā)現(xiàn)了新的免疫細胞CD62L+ ILC3。本研究通過對648個單細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，應用t-SNE細胞分型、SCDE基因差異表達分析，在ILC3中發(fā)現(xiàn)新的免疫細胞CD62L+ ILC3。

參考文獻：

Bjorklund, A.K., et al., The heterogeneity of human CD127(+) innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Immunol, 2016. 17(4): p. 451-60.