實時熒光定量PCR是一種分子生物學(xué)實驗手段，旨在通過實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，對特定DNA序列進(jìn)行定量分析。這種方法能夠準(zhǔn)確判斷患者體內(nèi)的病毒含量或特定基因的表達(dá)水平，為疾病的診斷和治療提供重要參考。

實時熒光定量PCR實驗原理

實時熒光定量PCR基于熒光能量傳遞技術(shù)，利用熒光基團(tuán)在PCR反應(yīng)過程中的累積來實時監(jiān)測整個反應(yīng)進(jìn)程。在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值(即熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，因此可以作為定量的依據(jù)。

實時熒光定量PCR實驗方法

1.樣品處理：采集患者體內(nèi)的分泌物或其他生物樣本作為待測樣品，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚硪蕴崛NA或RNA。

2.制備混合反應(yīng)液：將提取的DNA或RNA與PCR反應(yīng)液(包括引物、熒光基團(tuán)、酶等)混合，制備成PCR反應(yīng)體系。

3.設(shè)定熒光閾值：在PCR反應(yīng)開始前，設(shè)定一個熒光閾值，用于后續(xù)判斷Ct值。

4.CR擴增與熒光檢測：將混合反應(yīng)液置于PCR儀中進(jìn)行擴增，同時實時檢測熒光信號的變化。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，最終得到一條熒光擴增曲線圖。

5.數(shù)據(jù)分析：根據(jù)熒光擴增曲線圖，確定Ct值，并利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計算出待測樣品的起始拷貝數(shù)或表達(dá)水平。

送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)

送檢樣品需滿足一定的質(zhì)量和數(shù)量要求，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1.樣品類型：明確送檢的樣品類型，如血液、組織、分泌物等。

2.樣品數(shù)量：提供足夠數(shù)量的樣品，以確保實驗的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

3.保存條件：按照規(guī)定的保存條件(如溫度、濕度等)保存樣品，避免樣品降解或污染。

4.運輸條件：在運輸過程中保持樣品的穩(wěn)定性和完整性，避免樣品受損或變質(zhì)。

5.交付標(biāo)準(zhǔn)包括實驗報告和原始數(shù)據(jù)等，實驗報告應(yīng)詳細(xì)記錄實驗過程、結(jié)果和結(jié)論，原始數(shù)據(jù)則應(yīng)包括熒光擴增曲線圖、Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線等關(guān)鍵信息。

實時熒光定量PCR實驗應(yīng)用

實時熒光定量PCR已廣泛應(yīng)用于臨床及生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域中，具體包括：

1.臨床疾病診斷：用于檢測病毒感染等疾病的病原體含量，為疾病的診斷和治療提供重要參考。

2.基因表達(dá)分析：用于分析細(xì)胞、組織或樣品中的基因表達(dá)水平，了解基因在特定條件下的表達(dá)模式和調(diào)控機制。

3.遺傳學(xué)研究：用于基因突變和多態(tài)性分析，單核苷酸多態(tài)性(SNP)測定及易位基因的檢測等，為遺傳病的診斷和預(yù)防提供重要依據(jù)。

4.農(nóng)業(yè)研究：用于作物培育和遺傳學(xué)研究中，通過檢測植物基因組中的突變和表達(dá)量變化，評估作物的生長發(fā)育情況和適應(yīng)性。

注意事項

在進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗時，需要注意以下幾點以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性：

1.實驗環(huán)境：保持實驗環(huán)境的清潔和無菌，避免實驗污染問題。

2.試劑質(zhì)量：使用高質(zhì)量的PCR試劑和熒光基團(tuán)，確保實驗的靈敏度和特異性。

3.操作規(guī)范：嚴(yán)格按照實驗步驟進(jìn)行操作，避免操作失誤導(dǎo)致實驗結(jié)果異常。

4.儀器校準(zhǔn)：定期對PCR儀進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保儀器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

5.數(shù)據(jù)解讀：正確解讀實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)，避免誤判或漏判導(dǎo)致誤診或漏診。

【隆科生物合作項目】

1.病理檢測：石蠟包埋、切片、HE染色、masson染色、番紅固綠染色、天狼星紅染色、免疫組化、免疫熒光單標(biāo)/雙標(biāo)/多標(biāo)、全景掃描、激光共聚焦拍照等。

2.分子生物學(xué)實驗：熒光定量PCR檢測、Western blot檢測、血常規(guī)、生化酶活、ELISA檢測等。

3.細(xì)胞實驗：耐藥細(xì)胞株構(gòu)建、細(xì)胞毒性實驗、細(xì)胞遷移實驗、細(xì)胞侵襲實驗、細(xì)胞流式周期檢測、細(xì)胞流式凋亡檢測等。

4.動物實驗：動物模型構(gòu)建、動物飼養(yǎng)服務(wù)、動物臨床前研究、藥效評價、功能性評價等。

5.微生物學(xué)實驗：抑菌試驗、藥敏試驗、菌種鑒定、微生物多態(tài)性分析等實驗。