倒置 顯微鏡（Inverted Microscope）是一種專門設(shè)計(jì)用于觀察培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)瓶等容器中樣品的顯微鏡，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)以及其他生物醫(yī)學(xué)研究中。與傳統(tǒng)的正置顯微鏡不同，倒置 顯微鏡的物鏡位于樣品的下方，而光源位于樣品的上方。這種的設(shè)計(jì)使倒置 顯微鏡非常適合用于觀察細(xì)胞培養(yǎng)、活體細(xì)胞和厚樣品，特別是那些依賴液體環(huán)境進(jìn)行生長的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

倒置顯微鏡最早由荷蘭物理學(xué)家**費(fèi)爾納爾斯·霍爾登（Frits Zernike）**于20世紀(jì)初設(shè)計(jì)，目的是解決正置顯微鏡在觀察厚樣品時(shí)的局限性。現(xiàn)代倒置 顯微鏡通過結(jié)合相差顯微鏡、熒光顯微鏡、微分干涉顯微鏡等多種功能，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)、制藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域。

一、倒置 顯微鏡的工作原理

倒置 顯微鏡的主要工作原理與正置顯微鏡相同，都是通過光學(xué)系統(tǒng)將物體放大，但其設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)與光路有所不同。倒置 顯微鏡的物鏡安裝在載物臺(tái)下方，光源位于樣品的上方，光線從樣品上方透過樣品傳輸至下方的物鏡。通過這樣的設(shè)計(jì)，用戶可以在不影響樣品液體環(huán)境（如細(xì)胞培養(yǎng)液）的情況下，直接觀察底部貼壁生長的細(xì)胞。

倒置 顯微鏡主要通過以下幾個(gè)光學(xué)步驟完成成像過程：

1. 光源照射：光源從上方向下照射樣品，樣品中的光線經(jīng)過樣品底部傳入物鏡。

2. 物鏡放大：物鏡首先對(duì)光線進(jìn)行初步放大，形成放大的圖像。

3. 目鏡放大：目鏡進(jìn)一步放大物鏡形成的圖像，最終呈現(xiàn)給觀察者。

4. 圖像形成：最終成像可以通過目鏡直接觀察，也可以通過數(shù)碼相機(jī)記錄圖像。

二、倒置 顯微鏡的主要結(jié)構(gòu)與功能

倒置 顯微鏡的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與正置顯微鏡有一定的差異，以下是倒置 顯微鏡的主要組成部分：

1. 目鏡（Eyepiece）：

• 目鏡用于進(jìn)一步放大物鏡形成的圖像，常見放大倍數(shù)為10x或15x。

2. 物鏡（Objective Lens）：

• 倒置 顯微鏡的物鏡位于樣品的下方，直接對(duì)樣品進(jìn)行成像。物鏡的放大倍數(shù)通常為4x、10x、20x、40x以及100x。倒置 顯微鏡特別適合用于低倍至中倍放大倍率的觀察。

3. 載物臺(tái)（Stage）：

• 載物臺(tái)是用于放置樣品的區(qū)域，通常設(shè)計(jì)為大面積的平面臺(tái)，適合放置培養(yǎng)皿、多孔板或組織培養(yǎng)瓶。載物臺(tái)帶有夾具或滑動(dòng)平臺(tái)，便于樣品的移動(dòng)和對(duì)焦。

4. 光源與照明系統(tǒng)：

• 倒置 顯微鏡通常使用LED或鹵素?zé)糇鳛楣庠?，光線從樣品的上方照射，透過樣品進(jìn)入物鏡。倒置 顯微鏡的光源可調(diào)節(jié)亮度，以適應(yīng)不同樣品的觀察需求。

5. 調(diào)焦旋鈕（Focus Knob）：

• 調(diào)焦旋鈕分為粗調(diào)和微調(diào)，粗調(diào)用于快速對(duì)焦，微調(diào)用于精確調(diào)整焦距，特別是在高倍觀察時(shí)，微調(diào)對(duì)于圖像的清晰度至關(guān)重要。

6. 相差裝置（Phase Contrast Device）：

• 倒置 顯微鏡常配備相差觀察裝置，適用于無染色樣本的觀察，特別是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，用于觀察活細(xì)胞的輪廓和結(jié)構(gòu)。

7. 熒光模塊（Fluorescence Module）：

• 倒置 顯微鏡通常配備熒光模塊，用于觀察熒光標(biāo)記的樣本。熒光觀察適合分子生物學(xué)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)定位等實(shí)驗(yàn)。

8. 數(shù)字成像系統(tǒng)：

• 倒置顯微鏡可連接數(shù)碼相機(jī)或CCD攝像頭，通過成像軟件實(shí)時(shí)捕捉和分析樣本圖像，記錄細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

三、倒置 顯微鏡的分類

根據(jù)應(yīng)用場景和觀察方式的不同，倒置 顯微鏡可以分為以下幾種常見類型：

1. 明場倒置 顯微鏡（Bright-Field Inverted Microscope）

• 明場顯微鏡是最常見的倒置 顯微鏡類型，光線通過樣品的透射光進(jìn)行成像。它適合觀察經(jīng)過染色的細(xì)胞、組織切片以及透明度較高的懸浮細(xì)胞。明場顯微鏡的成像對(duì)比度低，適用于染色或透明樣本。

2. 相差倒置顯 微鏡（Phase Contrast Inverted Microscope）

• 相差顯微鏡利用光的相位差原理，提高透明樣本的對(duì)比度，尤其適合無染色的活體細(xì)胞或貼壁細(xì)胞的觀察。相差顯微鏡能夠清晰顯示細(xì)胞的邊界、細(xì)胞核和其他內(nèi)部結(jié)構(gòu)，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分裂觀察等實(shí)驗(yàn)。

3. 熒光倒置 顯微鏡（Fluorescence Inverted Microscope）

• 熒光顯微鏡通過激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)，使其發(fā)出特定波長的光來成像，適合用于觀察特定分子或細(xì)胞內(nèi)的熒光標(biāo)記。熒光顯微鏡在分子生物學(xué)、基因表達(dá)研究、蛋白質(zhì)標(biāo)記等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

4. 微分干涉倒置 顯微鏡（Differential Interference Contrast (DIC) Inverted Microscope）

• 微分干涉顯微鏡通過干涉光路增強(qiáng)樣品的立體感和對(duì)比度，適合觀察無染色的厚樣品和透明細(xì)胞。DIC顯微鏡能夠顯示細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于生物樣本、胚胎發(fā)育研究等領(lǐng)域。

四、倒置 顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域

倒置 顯微鏡在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥等多個(gè)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用，以下是常見的幾個(gè)應(yīng)用場景：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

倒置 顯微鏡是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中工具，尤其適合觀察貼壁細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等）的生長、分裂和遷移過程。研究人員通過倒置 顯微鏡能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測細(xì)胞的形態(tài)變化、增殖、凋亡和藥物反應(yīng)等。此外，懸浮細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、血液細(xì)胞）也能通過倒置顯 微鏡進(jìn)行觀察和分析。

2. 藥物篩選與毒性測試

在制藥領(lǐng)域，倒置 顯微鏡用于高通量藥物篩選實(shí)驗(yàn)，通過觀察細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)來評(píng)估藥物的效力和毒性。研究人員能夠通過成像系統(tǒng)記錄細(xì)胞在不同藥物作用下的形態(tài)變化、增殖抑制、凋亡等，進(jìn)一步優(yōu)化藥物研發(fā)。

3. 活體細(xì)胞成像

倒置 顯微鏡能夠配合培養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)行長時(shí)間的活體細(xì)胞成像，適合細(xì)胞行為研究和動(dòng)態(tài)變化的記錄。通過環(huán)境控制模塊（如溫度、CO2等），研究人員可以維持細(xì)胞在顯微鏡下的正常生長條件，進(jìn)行長時(shí)間的實(shí)時(shí)觀察。

4. 胚胎發(fā)育與顯微操作

在胚胎學(xué)研究中，倒置 顯微鏡廣泛用于觀察胚胎發(fā)育、細(xì)胞分裂和組織形成過程。倒置 顯微鏡的大視場和長工作距離使其適合胚胎操作和顯微注射實(shí)驗(yàn)，例如在小鼠胚胎或斑馬魚胚胎中進(jìn)行顯微操縱和基因編輯。

5. 分子生物學(xué)與熒光成像

熒光倒置 顯微鏡是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的核心工具，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、蛋白質(zhì)標(biāo)記、信號(hào)傳導(dǎo)等研究。通過熒光染料標(biāo)記，研究人員可以精確定位細(xì)胞內(nèi)特定分子或結(jié)構(gòu)，觀察它們的動(dòng)態(tài)變化。

五、倒置 顯微鏡的使用步驟

以下是使用倒置 顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞觀察的常規(guī)步驟：

1. 樣本準(zhǔn)備

將細(xì)胞或組織樣本放置在培養(yǎng)皿、多孔板或組織培養(yǎng)瓶中，確保樣本貼壁生長或分布均勻。

2. 安裝樣本

將準(zhǔn)備好的樣本放置在載物臺(tái)上，并使用夾具固定樣品。調(diào)節(jié)載物臺(tái)的位置，使樣本位于物鏡的正下方。

3. 選擇物鏡

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的物鏡，通?？梢詮?x或10x開始觀察整體結(jié)構(gòu)，再切換到20x或40x觀察細(xì)節(jié)。對(duì)于貼壁細(xì)胞，高倍物鏡（如40x）適合用于觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

4. 調(diào)節(jié)光源與對(duì)焦

使用粗調(diào)焦旋鈕將樣本大致對(duì)焦，然后使用微調(diào)焦旋鈕進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，直到圖像清晰為止。調(diào)節(jié)光源亮度，確保樣本照明均勻。

5. 觀察與成像

在觀察的過程中，可以根據(jù)需要切換不同的觀察模式（如相差、熒光等）。通過數(shù)碼相機(jī)或CCD設(shè)備拍攝圖像，并通過成像軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

6. 關(guān)機(jī)與維護(hù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，關(guān)閉光源和顯微鏡電源。清潔物鏡和其他光學(xué)元件，使用防塵罩保護(hù)顯微鏡，確保設(shè)備清潔和長時(shí)間穩(wěn)定使用。

六、倒置 顯微鏡的優(yōu)勢與局限性

優(yōu)勢

1. 適合細(xì)胞培養(yǎng)：倒置設(shè)計(jì)使得細(xì)胞培養(yǎng)皿和多孔板能夠直接放置，無需翻轉(zhuǎn)樣品，避免破壞細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境。

2. 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察：可以長時(shí)間連續(xù)觀察活體細(xì)胞，并通過成像設(shè)備記錄細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

3. 多功能集成：倒置  顯微鏡可以結(jié)合相差、熒光、DIC等多種觀察模式，適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需求。

4. 大工作距離：適合厚樣品和三維組織的觀察，尤其在胚胎學(xué)和顯微操作中表現(xiàn)出色。

局限性

1. 高倍觀察性能有限：與正置顯微鏡相比，倒置 顯微鏡在高倍觀察時(shí)可能存在一定的局限性，特別是在100x物鏡下的分辨率和清晰度方面。

2. 樣品要求：由于物鏡位于下方，樣品需要在透明容器中進(jìn)行觀察，否則會(huì)影響光的透射。

七、未來發(fā)展趨勢

隨著顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步，倒置 顯微鏡在功能上不斷擴(kuò)展，以下是一些未來的發(fā)展趨勢：

1. 超分辨率成像：隨著超分辨率顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，倒置 顯微鏡將能夠突破光學(xué)衍射極限，實(shí)現(xiàn)納米級(jí)別的細(xì)胞成像，進(jìn)一步推動(dòng)細(xì)胞和分子生物學(xué)的研究。

2. 智能自動(dòng)化：隨著人工智能和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，倒置 顯微鏡將逐漸實(shí)現(xiàn)自動(dòng)對(duì)焦、樣本識(shí)別和自動(dòng)成像，提高實(shí)驗(yàn)效率和圖像處理速度。

3. 多功能集成：未來的倒置 顯微鏡將更具靈活性和多功能性，如結(jié)合共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡、拉曼顯微鏡等多種功能，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和深度。

總結(jié)

倒置 顯微鏡憑借其的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和多功能擴(kuò)展性，成為細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、藥物篩選等領(lǐng)域的工具。它能夠?qū)崿F(xiàn)活體細(xì)胞的長時(shí)間動(dòng)態(tài)觀察，并通過結(jié)合熒光和相差等技術(shù)，幫助研究人員深入了解細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和行為。隨著顯微技術(shù)的不斷發(fā)展，倒置 顯微鏡將在生命科學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。