檢測原理：
在 HTRF 相互作用檢測中，一部分（直接或間接）用供體標記，另一部分用受體標記（同樣直接或間接）。信號強度與兩部分的結(jié)合成正比。在此處所示的例子中：單克隆抗體 Anti GST-Tb 穴狀化合物與帶 GST 標簽的 A部分結(jié)合，而B 部分* 與用 HTRF 受體標記的特異性抗體結(jié)合。* B部分也可以是化的、帶標簽的、Fc 融合的。在這些情況下，使用相應(yīng)的用受體標記的 HTRF 試劑（抗標簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進行檢測。

檢測方案：
右側(cè)的例子描述了使用 20 µL 最終檢測體積來檢測帶 GST 標簽的A部分和未帶標簽的B部分 * 之間相互作用的方案。分配兩個部分（10 µL），孵育，加入單克隆抗體 Anti GST-Tb 穴狀化合物（5 µL）和用受體標記的抗B部分（5 µL），孵育并讀取。* B部分也可以是化的、帶標簽的、Fc 融合的或直接標記的。在這些情況下，使用相應(yīng)的用受體標記的 HTRF 試劑（抗標簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進行檢測。

檢測細節(jié)：
測試次數(shù)與活性部分如何相關(guān)？
每孔的平均結(jié)合物數(shù)量反映了總體生物材料含量。通常優(yōu)選使用活性部分的量而不是總結(jié)合物的量。對于穴狀化合物和 d2 結(jié)合物，總結(jié)合物的量等于活性部分的量，因為標記的分子量可以忽略不計。對于用 XL665 標記的實體則不是這樣，總結(jié)合物的量將根據(jù) XL665 結(jié)合物的最終摩爾比而變化，然而，Revvity 提供的活性部分的量是恒定的，并且基于訂購的測試次數(shù)。

推薦的穴狀化合物和 XL665 結(jié)合物的量：
穴狀化合物結(jié)合物不能過量，以防止讀數(shù)器飽和和不可接受的背景水平。在大多數(shù)情況下，1 到 5nM 的穴狀化合物濃度是合適的，并且根據(jù)所使用的與 HTRF 兼容的讀數(shù)器，在 620nm 處將產(chǎn)生 20,000 到 80,000 cps。XL665 結(jié)合物必須盡可能與其檢測對應(yīng)物匹配，以便最大數(shù)量的生物分子被 XL665 受體標記。因此，要檢測濃度為 20nM 的帶標簽分子，抗標簽 - XL665 的濃度應(yīng)是等摩爾或更高。