諾博萊德 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產品貨號：M0198

產品名稱：His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

產品規(guī)格：5mL/2×50mL

產品簡介：

具體產品的參數(shù)以收到產品說明書的參數(shù)為準

NobleRyderM0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt具有超順磁性，專為高效、快速純化組an酸標簽蛋白而設計的一種新型功能化材料?？赏ㄟ^磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標蛋白，極大地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業(yè)領域便捷地進行組an酸標簽蛋白純化。

與傳統(tǒng)層析方式使用的金屬螯合瓊脂糖預裝柱相比，采用磁珠純化組an酸標簽蛋白，無需對樣品進行多次長時間的高速離心和濾膜過濾、無需控制流速、更無需高昂的層析設備。樣品與磁珠的特異性結合、洗滌以及目標蛋白的洗脫變得簡單、快速、易操作。對于熟練的操作者而言，在 1h 內就能獲得高純度的目標蛋白，且能輕松實現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理，為研究者節(jié)省了時間和成本。

本產品系列包括鎳離子（Nickel）、鈷離子（Cobalt）兩種金屬離子螯合磁珠，它們在目標蛋白結合量和非特異性吸附等性能上有所區(qū)別，用戶可根據(jù)目標蛋白與不同種類金屬的結合性能，以及對目標蛋白的產量和純度的要求，選擇不同種類的金屬離子螯合磁珠。

適用范圍：

適用于純化細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等分泌或胞內表達的可溶性組an酸標簽蛋白，也可用于變性蛋白的純化（包涵體需變性后再進行純化）。

操作步驟：（僅供參考）

1、緩沖液的準備

目標蛋白與組an酸標簽蛋白純化磁珠的結合性能將直接影響目標蛋白的純化效率，而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標蛋白的回收率和純度。因此，在較大規(guī)模蛋白純化之前，用戶應該自行設計實驗，篩選出適合純化目標蛋白的緩沖液體系，主要包括 BindingBuffer、WashingBuffer、Elution Buffer。

增加咪唑濃度進行洗脫是組an酸標簽純化磁珠*chang用的洗脫方法，shou次使用時，在不確定最佳的洗脫咪 唑濃度情況下，推薦在緩沖液中分別加入 10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300 mM、400mM、500mM mi唑，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液，之后通過 SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。

以下提供的緩沖液體系適用于多數(shù)組an酸標簽蛋白的純化，供用戶參考。

Binding Buffer： 20 mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，5~50mMImidazole，pH7.4

 Washing Buffer： 20mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，50~100mMImidazole，pH7.4

 Elution Buffer： 20 mMPhosphateBuffer，500 mMNaCl，500mMImidazole，pH7.4

 2、樣本處理

（1）大腸桿菌、酵母等細胞內表達蛋白：表達細胞用適量的 BindingBuffer 稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF），重懸細胞，冰浴超聲裂解細胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過于粘稠，可根據(jù)需要在粗樣品中加入適量核酸酶，冰浴 30min，以降解核酸。另外，用戶也可以根據(jù)實際需要對蛋白樣品進行離心操作。

（2）胞外表達蛋白：取胞外表達上清，用等量 BindingBuffer 稀釋，即為粗蛋白樣品。

（3）動物細胞胞內表達蛋白：取適量動物細胞，先用適量 PBS 洗滌 1 次，棄上清；接著用適量含 1%（v/v） TritonX-100 或 1%（v/v） NP-40 的BindingBuffer 重懸，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF），冰浴10min，即為粗蛋白樣品。

3、磁珠預處理

一般情況下，磁珠的使用量是由用戶根據(jù)目標蛋白產量和磁珠載量信息計算獲得。例如：采用大腸桿菌表達某目標蛋白，500mL 發(fā)酵液收獲 2g 濕重的菌體，通過預實驗估算其目標蛋白產量為 10～20 mg，用戶需要取 5mL 磁珠懸液用于目標蛋白的純化。以下即以此為例進行詳細說明：

（1）將磁珠產品置于漩渦混勻器上充分混勻，用移液器取 5mL 磁珠懸液于 15mL 離心管中，進行磁性分離*， 棄上清液，從磁性分離器上取下離心管。

（2）加入 5mLBindingBuffer 到上述裝有磁珠的離心管中，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸??；進行磁性分離，移去上清液。重復洗滌 2 次。

（*：在磁性分離過程中，為了減少磁珠在使用過程中的損耗，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子，保持離心管 仍在磁性分離器上，手持磁性分離器與離心管上下翻轉數(shù)次，使澄清的溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠，靜置片刻， 使溶液重新變澄清；以下同。）

4、目標蛋白與磁珠結合

（1）用 10mLBindingBuffer 懸浮 2g 濕重的菌體，進行破碎和裂解之后，即為目標粗蛋白樣品，加入到裝有預處理磁珠的離心管中，將離心管置于漩渦混勻器振蕩 15s。

（2）將離心管置于旋轉混合儀上，室溫旋轉混合 20~30min（如果需要，可以在 2~8℃ 的低溫環(huán)境下，旋轉混 1h， 防止目標蛋白降解）。

（3）將離心管置于磁性分離器上進行磁性分離，移出上清液至新的離心管中以備后續(xù)檢測，從磁性分離器上取下離心管進行后續(xù)洗滌步驟。

5、磁珠洗滌

（1）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管中，輕輕翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測。重復此步驟 1 次。

（2）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉移到新的離心管（避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標蛋白），磁性分離，移出上清液到清洗液收集管。

6、目標蛋白洗脫

（1）用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調整目標蛋白濃度，加入 2~10mLElutionBuffer，輕輕翻轉離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標蛋白樣品。

（2）如果需要，可以重復上述步驟 1 次，收集樣品到新的離心管中，以檢測目標蛋白是否洗脫wan全。

7、磁珠后處理

（1）在裝有磁珠的離心管中加入 5mLElutionBuffer，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離， 去除上清液。

（2）重復上述步驟 2 次。

（3）在離心管中加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。

（4）重復上述步驟 2 次。

（5）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL，保存于 2~30℃（長期保存，置于 2~8℃），可用于下一次同種蛋白的純化。

8、磁珠再生

磁珠連續(xù)使用三次以上，其結合目標蛋白的能力可能會明顯降低，建議進行磁珠再生處理。

Stripping Buffer：20 mM SodiumPhosphate，500mMNaCl，100mMEDTA， pH7.4

BeadsWashing Buffer（可選）：0.5MNaOH，2MNaCl

Recharge Buffer：100 mMNiSO4/ CoCl2 （該化學試劑具有一定的毒性，可能造成過敏反應，使用時務必注意自身安全）

Storage Buffer：20%（v/v）乙醇

以 5mL10%（v/v）磁珠懸液為例，詳細說明磁珠再生操作：

（1）將磁珠懸液進行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入 5mLddH2O， 上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。

（2）加入 5mLStrippingBuffer，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合 5min，磁性分離，去除上清液。重復此步驟 1 次。

（3）加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重復

此步驟 2 次。

（4）堿處理：加入 5mLBeadsWashingBuffer，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合 5min，磁性分離，去除上清液。加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復 ddH2O 洗滌步驟 3~5 次，至洗滌液呈中性為止。

（5）加入 5mLRechargeBuffer，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合 20min，磁性分離，去除上清液。

（6）加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復此步驟 4 次以上，保證鎳離子去除wan全。

（7）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL，保存于 2~30℃ （長期保存，置于 2~8℃）

蛋白純化流程的優(yōu)化

以上操作流程適用于大部分組an酸標簽蛋白的純化，根據(jù)目標蛋白與金屬離子螯合磁珠的結合性能不同， 用戶可以從以下幾個方面對純化流程進行優(yōu)化，以提高目標蛋白的回收率和純度。

提高目標蛋白回收率的參考方法：

（1）降低樣品溶液和BindingBuffer 中的 Imidazole 濃度；

（2）樣品溶液和其它緩沖液中添加表面活性劑等物質；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；

（4）增加磁珠用量；

（5）延長蛋白與磁珠孵育的時間；

（6）延長洗脫目標蛋白的時間或增加洗脫次數(shù)。

提高目標蛋白純度的參考方法：

（1）提高樣品溶液和BindingBuffer 中 Imidazole、NaCl 的濃度；

（2）樣品和緩沖液中添加表面活性劑等物質；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；

（4）延長洗滌的時間，增加洗滌次數(shù)；

（5）采用梯度 Imidazole 濃度洗脫目標蛋白。

注意事項

1、shou次使用本產品前，請務必詳細閱讀本用戶手冊；

2、磁珠使用和保存過程中應避免冷凍、干燥和高速離心等操作；

3、在使用本產品前，請務必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態(tài)；

4、請選用質量好的移液器吸頭和離心管，以免磁珠貼壁或混合過程發(fā)生滲漏引起磁珠的損耗；

5、磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉離心管重懸磁珠，可采用移液器反復吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；

6、用戶可根據(jù)實際需要保留經磁性分離移去的上清液，進行取樣檢測，以便分析純化過程和優(yōu)化蛋白純化流程；

7、本產品可以重復使用，當純化性能降低時，建議進行再生處理；

8、使用過的磁珠重復使用時，建議純化同種蛋白，純化不同種類的蛋白時，建議使用新的磁珠；

9、本產品需與磁性分離器配套使用；

10、本產品僅供研究使用。

 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產品訂購信息

M0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt  5mL/2×50mL