谷an酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

谷an酸合成酶試劑盒 氮代謝

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

GOGAT 分布于植物中，和谷an酰胺合成酶共同構(gòu)成 GS/GOGAT 循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。

測定原理：

GOGAT 催化谷an酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷an酸；同時(shí) NADH 氧化生成NAD⁺， 340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

工作液的配制：在試劑二中加入 25ml 試劑一充分溶解混勻，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 3h 內(nèi)用完）；

取 0.1ml 樣本和 0.9ml 工作液于 1ml 比色皿中，混勻，加工作液的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在 340 nm 波長下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

GOGAT 活性計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GOGAT（nmol /min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V×樣Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GOGAT（nmol /min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GOGAT（nmol /min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.642×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

谷an酸合成酶試劑盒 氮代謝