抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性測(cè)定試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一。APX 具有多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質(zhì)、線粒體、過(guò)氧化物和乙醛酸體，以及過(guò)氧化體和類(lèi)囊體膜上。APX 催化 H2O2 氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影響到 AsA 的含量，APX 與AsA 具有一定的負(fù)相關(guān)性。

測(cè)定原理：

APX 催化催化H2O2 氧化AsA，通過(guò)測(cè)定AsA 氧化速率，來(lái)計(jì)算得 APX 活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5 ml 蒸餾水充分溶解。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1ml 石英比色皿、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測(cè)。

測(cè)定：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 290nm，用蒸餾水調(diào)零。

試劑一在 25℃中預(yù)熱 30min。

依次在 1ml 石英比色皿中加入 100μl 上清液、700μl 預(yù)熱的試劑一、100μl 試劑二和 100μl 試劑三，迅速混勻后在 290nm 測(cè)定 10 s 和 130 s 光吸收A1 和A2，△A=A1-A2。

APX 活性計(jì)算公式：

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反總×109÷(Cpr×V 樣)÷T=1786×△A÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每g 組織每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d）×V 反總×109÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1786×△A ÷W

ε：AsA 在 290nm 處摩爾吸光系數(shù)為 2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μl=1×10-3 L；109：1mol=1×109nmol；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（ml），100μl=0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

注意事項(xiàng)：

配制好的試劑二 4℃保存，并且 3 天內(nèi)使用完。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性測(cè)定試劑盒