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脾臟（spleen）位于上腹部左后側(cè)，體積較大，長(zhǎng)條形，是體內(nèi)最大的淋巴器官，也是血流通路中的過濾器官。脾臟內(nèi)定居著大量的淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞，是機(jī)體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答的場(chǎng)所。

1    原理

單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與其它細(xì)胞不同，在沉降過程中不同比重的細(xì)胞會(huì)處于不同的分布位置。因此，可利用各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離開來。

2    方法

1）無菌條件下取出脾臟，在培養(yǎng)皿中加入適量的分離液，將脾臟放入細(xì)胞篩中，置于分離液中進(jìn)行研磨（具體方法見示意圖1）。

圖1 脾臟研磨方法示意圖

2）將懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移入無菌離心管中，在上層覆蓋適量的RPMI 1640培養(yǎng)基，且需保持液面分界清晰。

3） 800g，室溫，離心 20min-30min（注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔）。

4） 離心結(jié)束后，吸棄RPMI 1640培養(yǎng)基，小心吸取脾臟單個(gè)核細(xì)胞層（即白膜層）并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為RPMI 1640培養(yǎng)基層、脾臟單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層和紅細(xì)胞層（見圖2）。

圖2 細(xì)胞懸液離心前后的分層狀態(tài)圖

5）向離心管中加入10mL 的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3    注意事項(xiàng)

1）不同種屬動(dòng)物單個(gè)核細(xì)胞的比重有一定差異，請(qǐng)選擇合適的分離液進(jìn)行脾臟單個(gè)核細(xì)胞的分離。

2）分離液易揮發(fā)，在脾臟研磨過程中請(qǐng)盡量縮短時(shí)間，將研磨時(shí)間控制在5min以內(nèi)。

3）研磨過程中請(qǐng)盡量控制研磨力度，保證細(xì)胞篩懸空，避免在培養(yǎng)皿底部直接研磨而造成細(xì)胞大量死亡。

4）若研磨后細(xì)胞懸液呈暗紅色，需將其進(jìn)行適量稀釋后再進(jìn)行后續(xù)操作。

5）為保證細(xì)胞的活力，整個(gè)操作過程請(qǐng)輕柔，避免對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性的損傷。

6）為保持細(xì)胞狀態(tài)良好，請(qǐng)盡量縮短整個(gè)試驗(yàn)的周期。

4    脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒

IPHASE/匯智和源針對(duì)不同種屬動(dòng)物脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離的特點(diǎn)，開發(fā)了對(duì)應(yīng)的單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒，包括人，猴，犬，大鼠，小鼠，兔，豬等。該試劑盒包含單個(gè)核細(xì)胞分離液和洗滌液兩個(gè)組分，各成分對(duì)細(xì)胞無毒性，不會(huì)影響細(xì)胞的原始狀態(tài)；同時(shí)，該試劑盒操作簡(jiǎn)單便捷，可大大縮短細(xì)胞分離時(shí)間，分離所得細(xì)胞純度高、狀態(tài)好、得率高。

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