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使用 Liberty Blue™ 和 Liberty PRIME™ 多肽合成儀可以快速、高純度進行頭尾環(huán)化肽的全自動合成。微波增強的多肽固相合成（SPPS）不僅有利于線性組裝，而且有利于隨后的環(huán)化步驟，在各種困難的生物學重要肽上實現(xiàn)了ji高的純度合成。Liberty PRIME 上使用的一鍋法 Fmoc SPPS 循環(huán)進一步改善合成時間、減少浪費。

表1 ：全自動合成首尾相連的環(huán)化肽

表2：Liberty Blue 和 Liberty PRIME 合成 Cyclorasin A¹

引言

環(huán)肽能夠橋接小分子和抗體之間的化學空間間隙，允許設計具有高結合親和力、顯著選擇性、低毒性和進入細胞內靶點的能力的分子²。因此，大環(huán)肽作為靶向傳統(tǒng)上無法成藥的生物靶點的治療劑具有相當大的前景³。截至 2017 年，超過 40 種環(huán)肽用于臨床⁴。環(huán)肽作為候選藥物開發(fā)的這一令人鼓舞的趨勢，為發(fā)展更穩(wěn)健的制備方法提供了動力。

SPPS 可以通過使用 Fmoc-Glu-ODmab 作為 C 端氨基酸 (圖 1) 制備首尾相連環(huán)化肽。在合成線性肽骨架后，可以使用稀肼溶液選擇性地去保護 Dmab 基團。之后，可以使用微波增強偶聯(lián)實現(xiàn)首尾環(huán)化。將微波能量應用于首尾環(huán)化肽的合成可以實現(xiàn)更有效的偶聯(lián)，從而加快合成時間和提高純度 (CarboMAX™)⁵。

圖 1：Fmoc-Glu-ODmab ( 左 ); 

Fmoc-Glu(Wang resin LL)- ODmab (右)

材料與方法

試劑

以下含有zhi定的側鏈保護基團 Fmoc 氨基酸購自 CEM Corporation (Matthews, NC) 并：Ala、Arg (Pbf)、Gly、His (Boc)、Ile、Leu、Lys (Boc)、Thr (tBu) )、Trp (Boc)、Tyr (tBu) 和 Val。Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購自 CEM Corporation。Fmoc-Glu-ODmab、Fmoc-Glu(Wang)-ODmab LL 樹脂、FmocD-Ala- OH 和 Fmoc-4-氟-L-苯丙氨酸購自 EMD Millipore (Burlington, MA)。Fmoc-D-2-Nal-OH、FmocD-Nle-OH 和 Fmoc-N-甲基-L-苯丙 氨酸購自 Bachem (T orrance, CA)。Fmoc-N-甲基-異亮氨酸-OH 購自 Advanced ChemTech (Louisville, KY)。FmocN-甲基-亮氨酸-OH 購自 Alfa Aesar (Haverhill, MA)。水合肼、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、Fmoc-N-甲基-甘氨酸-OH、N,N'-二異丙基碳二亞胺 (DIC)、哌啶、吡咯烷、三fu乙suan (TFA)、3,6-dioxa-1、 8 辛二硫醇(DODT) 和三異丙基硅烷 (TIS) 購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、無水乙mi (Et2O) 和乙酸購自 VWR (Radnor, PA)。LC-MS 級水 (H2O) 和 LC-MS 級乙腈 (MeCN) 購自 Fisher Scientific (Hampton, NH) 。

多肽合成：CEM 7-mer, cyclo-[GVYLHIE] 

使用 CEM Liberty Blue 自動微波多肽合成儀，在 Fmoc- Glu(Wang)- ODmab 樹脂（離子交換容量：0.025 meq/g）上，以 0.10 mmol 的規(guī)模合成（Dmab 脫保護以0.05 mmol 規(guī)模進行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol的規(guī)模進行）。使用 DMF 中的哌啶進行脫保護。

偶聯(lián)反應在5倍量的Fmoc氨基酸,DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵ 中進行。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環(huán)化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后無水乙mi沉淀肽并過夜凍干。

圖2：CEM 7-mer

使 用 CEM Liberty Blue 自 動 微 波 多 肽 合 成 儀 ， 在 Rink Amide ProTide LL 樹脂 (離子交換容量：0.19 meq/g ）上，以 0.05 mmol 的規(guī)模合成（Dmab脫保護以 0.05 mmol 的規(guī)模進行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進行）。使用 DMF 中的哌啶進行脫保護。偶聯(lián)反應在5倍Fmoc氨基酸、DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵中進行。Fmoc-Glu-ODmab 用做第一個氨基酸（Q）。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環(huán)化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并過夜凍干。

多肽合成：Cyclorasin A, cyclo-[WTaRRR-nal-R-Fpa-nle-Q](Liberty PRIME)

使用 CEM Liberty PRIME 自動微波多肽合成儀，在  Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上，以 0.05 mmol 規(guī)模合成（Dmab脫保護以 0.05 mmol 的規(guī)模進行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進行）。使用 DMF 中的吡咯烷進行脫保護。偶聯(lián)反應在5倍 Fmoc 氨基酸、DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵中進行。Fmoc-Glu-ODmab 用做第一個氨基酸（Q）。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環(huán)化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H₂O/TIS/ DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

圖3：Cyclorasin A

使用 CEM Liberty PRIME 自動微波肽合成儀在 Fmoc-Glu (Wang ) -ODmab 樹脂（離子交換容量：0.25 meq/g ）上以 0.05 mmol 的 規(guī)模合成（Dmab 脫保護以 0.05 mmol 規(guī)模進行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進行）。使用 DMF 中的吡咯烷進行脫保護。偶聯(lián)反應在5倍 Fmoc 氨基酸、DIC和Oxyma Pure（CarboMAX）⁵中進行。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環(huán)化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在CEM RazorTM高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽 并凍干過夜。

圖4：N-Methyl Cyclorain Analog

使 用 CEM Liberty PRIME 自 動 微 波 肽 合 成 儀 在 Fmoc-Glu (Wang )-ODmab 樹脂（離子交換容量：0.25 meq/g ）上以 0.1 mmol 的規(guī)模合成（Dmab 脫保護以 0.05 mmol 規(guī)模進行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進行）。使用 DMF 中的吡咯烷進行脫保護 。偶 聯(lián) 反 應 在 5 倍 Fmoc 氨 基 酸 、 DIC和Oxyma Pure（CarboMAX）⁵中進行。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環(huán)化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

圖5： Poly N-Methyl Peptide

在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上分析肽， 該 檢 測 器 配 備 Acquity UPLC BEH C8 柱 （1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到 Waters 3100 Single Quad MS 用于結構測定。在 Waters MassLynx 軟件上進行峰分析。使用 (i) H2O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脫進行分離。

結果

在 Liberty Blue 自動微波肽合成儀上 CEM 7-mer 的微波增強固相合成產生了純度為 78% 的目標肽（圖 6）。

圖6：CEM 7-mer 的UPLC色譜圖

在 LibertyBlue 自動微波肽合成儀上的 Cyclorasin A的微波增強。

圖7：Cyclorasin A (Liberty Blue)的UPLC的色譜圖

Liberty PRIME 自動微波肽合成儀上的 Cyclorasin A 微波增強。

圖8：Cyclorasin A (Liberty PRIME)的UPLC色譜圖

Liberty PRIME 自動微波肽合成儀上的 Poly N-Methyl Peptide。

圖9：多聚N-甲基Peptide 的UPLC色譜圖

Liberty PRIME 自 動 微 波 肽 合 成 儀 上 的 N-Methyl Cyclorasin Analog 的微波增強固相合成產生了純度為 66% 的目標肽（圖10）。

圖10：N-甲基 CyclorasinAnalog的UPLC色譜圖

結論

使用自動微波增 SPPS 可以快速有效地合成首尾環(huán)肽。此外，易于使用的 Liberty Blue 和 Liberty PRIME 軟件允許對肽序列進行快速直接的編程。使用 Liberty Blue 肽合成儀在 2 小時 13 分鐘內合成了純度為 78% 的 7 聚體環(huán)肽。在 Liberty Blue 上在 3 小時 1 分鐘內以高純度 (75%) 合成了 Cyclorasin A 環(huán)肽。在 Liberty PRIME 上僅用了 2 小時就合成了相同的肽，純度很高 (75%)，浪費大約 100 mL。在 Liberty PRIME 上，微波增強的 SPPS 可在 2 小時 5 分鐘內以 66% 的純度合成了具有綜合挑戰(zhàn)性的 N-methyl cyclorasin analog 環(huán)肽。后，在 Liberty PRIME 上以 73% 的純度在 2 小時 12 分鐘內制備出多聚 N-甲 基化 11 聚體肽。 

參考文獻

[1] Upadhyaya, P.;Qian, Z.; Selner, N. G.; Clippinger, S. R.; Wu, Z.; Briesewitz, R.; Pei, D. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015, 54 (26), 7602–7606. 

[2] White, A. M.; Craik, D. J. Expert Opin. Drug Discov. 2016, 11 (12), 1151–1163.

[3] Hurtley, S. M. Science. 2018, 361 (6407), 1084.4-1085. (4) Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. (5) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”