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輕松搞定原代肝細胞分離提取,關(guān)鍵在這!

檢測樣品:原代肝細胞 肝細胞 PrimaryHepatocytes 肝細胞分離 肝細胞提取

檢測項目:原代肝細胞 肝細胞 PrimaryHepatocytes 肝細胞分離 肝細胞提取

方案概述:肝臟作為藥物暴露的主要器官,在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細胞(PrimaryHepatocytes)具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子,既包括膜結(jié)合酶【如細胞色素P450(CytochromeP450)混合功能氧化酶】,也包括胞質(zhì)酯酶,擁有肝臟中所有的代謝途徑。

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更新時間2025年04月02日

上傳企業(yè)匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司

下載方案

Keywords:原代肝細胞;Primary Hepatocytes; 肝細胞分離;肝細胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol;Isolation of Primary Hepatocytes

肝臟作為藥物暴露的主要器官,在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細胞(Primary Hepatocytes)具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子,既包括膜結(jié)合酶【如細胞色素P450(Cytochrome P450)混合功能氧化酶】,也包括胞質(zhì)酯酶,擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此,原代肝細胞(Primary Hepatocytes)被廣泛認為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn),在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。

圖片2.png

一、原代肝細胞分離方法

肝細胞分離(Isolation of Primary Hepatocytes)和肝細胞提取提取有直接剪切法、組織塊培養(yǎng)法、胰蛋白酶消化法、兩步膠原酶灌注法(Seglen灌注法)、半原位膠原酶灌注法等。

【直接剪切法】

原理:將肝臟切成小塊,然后用膠原酶或胰蛋白酶進行消化,分離得到肝細胞。

優(yōu)點:操作簡單,適用于大量細胞的分離。

缺點:細胞損傷較大,純度較低。

【組織塊培養(yǎng)法】

原理:將肝臟切成小塊,在培養(yǎng)皿中加入含特定生長因子的培養(yǎng)液進行培養(yǎng),使組織塊貼壁生長,然后逐漸分離得到肝細胞。

優(yōu)點:能夠保持細胞的天然狀態(tài),適用于長期培養(yǎng)。

缺點:操作較為繁瑣,細胞數(shù)量較少。

【胰蛋白酶消化法】

原理:用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進行消化,分離得到肝細胞。

優(yōu)點:能夠較為徹-底地分解細胞間物質(zhì),獲得較純的肝細胞。

缺點:胰蛋白酶的價格較貴,成本較高。

【兩步膠原酶灌注法(Seglen灌注法)】

原理:用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中,使肝實質(zhì)細胞與間質(zhì)分開,然后收集分離得到肝實質(zhì)細胞。

優(yōu)點:能夠保持細胞的天然狀態(tài),適用于長期培養(yǎng)。

缺點:操作較為繁瑣,細胞數(shù)量較少。

【半原位膠原酶灌注法】

原理:將肝臟放置在特定裝置中,通過門靜脈灌注膠原酶溶液,使肝臟在生理狀態(tài)下進行消化,然后收集分離得到肝實質(zhì)細胞。

優(yōu)點:能夠較為真實地模擬生理狀態(tài),獲得的細胞形態(tài)、活性較好。

缺點:操作較為復(fù)雜,成本較高。

其中,兩步膠原酶灌流法因其對肝細胞損傷作用較小,肝細胞產(chǎn)率和存活率高,成為了分離原代肝細胞的經(jīng)典方法。

二、原代肝細胞分離流程

鑒于此,IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,在兩步膠原酶灌注的基礎(chǔ)上,開發(fā)了原代肝細胞分離試劑盒,有標(biāo)準(zhǔn)的分離流程(Hepatocyte Isolation Protocol),其內(nèi)整合了包括灌流液、膠原酶、細胞洗滌液、細胞純化液、試驗耗材等在內(nèi)的所有組分,可適用于大鼠、小鼠等多個種屬原代肝細胞的分離。以下為詳細實驗流程:

1、實驗材料

1)動物:空白健康的6~8周雄性SD大鼠

2)儀器:恒溫水浴鍋、水平離心機、移液器、生物安全柜

3)試劑:膠原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化終止液、分離液添加劑、肝細胞純化液

4)耗材:0.22um過濾器、20ml無菌注射器、10ml無菌注射器、5ml無菌注射器、無菌紗布、無菌剪刀、無菌鑷子、無菌燒杯、無菌擦手紙、無菌50mL離心管及巴氏吸管

2、試劑預(yù)處理

1)灌流溶液A:實驗前37℃水浴預(yù)熱30分鐘。

2)灌流溶液B:實驗前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶,充分溶解后用0.22µm過濾器過濾。過濾后的溶液加入100uL分離液添加劑,然后37℃水浴預(yù)熱30分鐘。

3)消化終止液:實驗前在無菌條件下,每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑,混勻后置于冰上備用。

3、實驗步驟及結(jié)果

(一)  肝臟獲取

1)盡可能于半分鐘內(nèi)將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進行全身消毒,并轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。

2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起,并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開,以裸露腹部肌肉部位。

3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開,使肝臟充分暴露,注意不要將大鼠內(nèi)臟器官剪破。

(二)  組織處理

1)用剪刀剪開圖A所示位置,剪至能清晰可見每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔,使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A,將每葉肝臟都灌注至土黃色。

圖片3.png

2)使用10mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液B,直至肝臟軟爛。

(三)  細胞獲取

1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀,補加灌流溶液B至30mL.

2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌。

圖片4.png

3)消化結(jié)束后按照混懸液與消化終止液1:1的比例加入消化終止液。

4)無菌紗布過濾即得肝細胞懸液。

(四)  細胞洗滌

1)將肝細胞懸液輕輕顛倒混勻,分裝至50mL離心管。

2)70g(升速 3、降速 3)、4℃離心 5min。

3)在超凈工作臺中棄上清,消化終止液重懸細胞沉淀。

圖片5.png

(五)   細胞純化

1)按照 7:3 的比例(即細胞懸液:肝細胞純化液)加入肝細胞純化液并混勻。

2)100g(升速 3、降速 3)、4℃離心 10min。

3)棄上清,使用凍存液將細胞重懸,并于液氮罐中保存。

圖片6.jpg

如圖所示,該圖為IPHASE技術(shù)人員此次共分離得到的SD大鼠新鮮肝細胞照片,經(jīng)0.4%臺盼藍染色后發(fā)現(xiàn)細胞活率在90%以上,且數(shù)量共有80million,說明以IPHASE原代肝細胞分離試劑盒為提取材料,可獲得純度高、活率好且數(shù)量多的新鮮原代肝細胞!

三、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,深刻識到原代肝細胞(Primary Hepatocytes)是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn),在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞。因此,在兩步膠原酶灌注法的基礎(chǔ)上研發(fā)了原代肝細胞分離試劑盒,在標(biāo)準(zhǔn)的肝細胞分離流程(Hepatocyte Isolation Protocol)下進行肝細胞分離(Isolation of Primary Hepatocytes)和肝細胞提取,并以SD大鼠為實例,證明該試劑盒、該方法具有實用性!除此以外,IPHASE以相似分離流程,研發(fā)、生產(chǎn)了多種屬、多規(guī)格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細胞,供客戶購買使用,為客戶縮短時間,節(jié)約成本!

產(chǎn)品

種屬

規(guī)格

原代肝細胞分離試劑盒

多種屬

1

新鮮/凍存懸浮肝細胞

///大鼠/小鼠/////金黃地鼠

2/5 miliion

新鮮/凍存貼壁肝細胞

///大鼠/小鼠///

2/5 miliion

培養(yǎng)基

復(fù)蘇/鋪板/維持/代謝

10/20/50 mL

膠原包被板

6/12/24/48/96

1/5

超低吸附培養(yǎng)板平底

6/12/24/48/96

1/5

超低吸附培養(yǎng)板U

96

1/5









IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢:

合規(guī)性:生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得,來源清晰。

安全性:生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測,保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

高質(zhì)量:生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴格的內(nèi)部質(zhì)控,且同批次數(shù)量多,批次間差異性小。

可定制:可根據(jù)客戶特殊需求,提供特殊種屬肝細胞的定制服務(wù)。

8.png

發(fā)    文    章    得    獎    勵

凡使用本公司產(chǎn)品,在國內(nèi)及國際刊物上發(fā)表論文(論文發(fā)表日起一年內(nèi)),并注明產(chǎn)品屬于我司所有,即可申請獎勵。根據(jù)發(fā)表刊物影響因子不同,給予不同金額獎品:

非SCI論文及IF≤5分,500元禮品;

5分<IF≤8分 800元禮品;

8分<IF≤10分 1000元禮品;

IF≥10分 2000元禮品;

我司標(biāo)準(zhǔn)信息如下

【中文簡稱】匯智和源

【中文全稱】匯智和源生物技術(shù)(蘇州)有限公司

【英文名稱】IPHASE Biosciences

注:①禮品卡也可兌換同等金額產(chǎn)品購買抵用券;

    ②如遇我司公司名稱書寫不規(guī)范或不是第一作者等情況,對應(yīng)獎品將無法發(fā)放,敬請諒解!

關(guān)    于    我    們

匯智和源,致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學(xué)研究機構(gòu)提供高品質(zhì)的生物試劑,IPHASE為公司核心品牌,品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。

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