冠狀病毒因為包膜上密布著類似日冕的棘突而得名，屬于冠狀病毒科，正冠狀病毒亞科的冠狀病毒屬。根據(jù)血清學和基因組學特點，該屬名代表了α、β、γ和δ四個屬。目前已知感染人的冠狀病毒包括7種，即α屬的普通冠狀病毒HCoV?229E和HCoV?OC43，β屬的HCoV?NL63、HCoV?HKU1、嚴重急性呼吸綜合征（SARS）-CoV和中東呼吸綜合征（MERS）-CoV，以及此次導致武漢不明原因肺炎的2019-nCoV。其中，HCoV?HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV可以導致人類肺炎，其他是成人普通感冒的病原，兒童較敏感，可致上呼吸道感染。
早在2008年的《Cell》中，一組來自日本科學家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細胞核呈現(xiàn)紅色，而另一種使得S/G2/M期細胞核呈現(xiàn)出綠色，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細胞周期標志物（Fucci）。
早在2008年的《Cell》中，一組來自日本科學家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細胞核呈現(xiàn)紅色，而另一種使得S/G2/M期細胞核呈現(xiàn)出綠色，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細胞周期標志物（Fucci）。
圖1 Cell封面圖片：處于不同細胞周期的細胞核發(fā)出紅色或綠色熒光
圖2 LMD-切割細胞的典型周期狀態(tài)
利用這一發(fā)現(xiàn)，來自德國吉森大學藥理學的Poppe與他的合作者們研究了冠狀病毒對細胞NF-κB通路和染色質(zhì)分布的影響。
研究人員首先用HCoV-229E感染A549肺癌細胞模型，然后通過激光顯微切割（LMD6000）結(jié)合免疫熒光用于分解（i）被HCoV-229E感染的細胞，（ii）與感染細胞緊鄰的細胞，（iii）距離感染細胞至少150μm的細胞（“遠端細胞”）和（iv）單獨的未感染的細胞。
圖3 細胞株示意圖
他們分離了表達冠狀病毒N蛋白的細胞，并提取了整個RNA。
圖4 借助免疫熒光和激光顯微切割分離細胞株
Laser microdissection實驗過程：
Leica激光顯微切割系統(tǒng)優(yōu)勢
圖5 LMD切割示意圖
接著，研究人員通過利用RT-qPCR和微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與感染細胞緊鄰的細胞在單細胞水平上表征與存在于相同或不同培養(yǎng)物中的相鄰的未感染細胞相反，感染后的基因表達發(fā)生了變化。并通過HCoV-229E病毒N蛋白的免疫熒光（DMIRE2，DMi8）分析來監(jiān)測HCoV-229E感染并在A549細胞中擴散。
病毒學中熒光顯微鏡可以更好地滿足研究人員的需求。然而，在對動物組織進行研究時，仍有機會進行明場顯微鏡檢查，比如檢查病毒感染后組織的形態(tài)變化等。
此外，在細胞培養(yǎng)實驗室中使用明視野顯微鏡檢查已經(jīng)感染或?qū)腥镜募毎―M IL，DMi1，PAULA）的健康狀況和生長狀態(tài)。
圖6 極化上皮細胞MDCK的明場圖像
Leica顯微鏡在病毒學中的應(yīng)用遠不止這些，而這些看似基礎(chǔ)的研究工作恰恰起到了直接作用。另外還有其他用于病毒可視化的技術(shù)，例如電子顯微鏡(EM)可以分解病毒顆粒、單分子檢測(TCS SP8 SMD)、熒光壽命成像(FLIM) (STELLARIS 8 FALCON)以及多光子顯微鏡(SP8 DIVE)是適用于病毒學的其他方法，這些今后為您介紹。
參考文獻：
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