軟硬兼施—Leica打造的3D腫瘤球培養(yǎng)的解決方案
生命誕生于3D環(huán)境，所以傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方法，雖然可以保證細(xì)胞的生長和對外界刺激產(chǎn)生生理反應(yīng)，但是和實(shí)際生活環(huán)境的巨大差異會導(dǎo)致大部分生理功能受限。比如，2D培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞間的相互作用是XY軸的，只是細(xì)胞層之間的作用，缺乏Z軸方向的影響，這樣就沒有養(yǎng)料、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用。而3D培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞可以變成細(xì)胞球，從而可以體現(xiàn)出Z軸細(xì)胞之間的力作用和各種物質(zhì)的滲透梯度，和體內(nèi)的差異相較2D細(xì)胞層會大大縮小，從而提高體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
最近的統(tǒng)計(jì)表明每年會有370萬新增癌癥病例在歐洲發(fā)生，這些疾病會導(dǎo)致20%的死亡率。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞來高通量的篩選新的有效的藥物對于挽救癌癥病人非常重要，而3D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞球是合適的模型，但是這種細(xì)胞模型也有其瓶頸。因?yàn)?D細(xì)胞球的培養(yǎng)方案不統(tǒng)一，而且生長環(huán)境較之2D復(fù)雜，所以最終養(yǎng)成的球體異質(zhì)性會較之2D細(xì)胞層嚴(yán)重，而藥物的篩選需要有盡量均一的樣本，這樣最終得到的藥物敏感數(shù)據(jù)才準(zhǔn)確可信。為了解決這樣的情況，需要對培養(yǎng)出來的腫瘤球進(jìn)行挑選，然后放到孔板中，但是傳統(tǒng)的挑選方法是用人為的用肉眼挑選，這樣會導(dǎo)致效率的低下，而且個人的差異會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，再者如果直徑500微米一下的球體挑選難度就會更大。此外，對3D球體在鏡下和攝像頭下的成像也容易受到光源、培養(yǎng)基濃度和培養(yǎng)器皿的形狀而影響，從而更加增加觀察者肉眼判讀的不統(tǒng)一性。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
而現(xiàn)在市面上進(jìn)行細(xì)胞球培養(yǎng)和掃描/拍攝的設(shè)備，但是還沒有能進(jìn)行挑選和轉(zhuǎn)移設(shè)備，為了解決這一問題匈牙利的Istvan Grexa等人利用徠卡顯微系統(tǒng)的S9i體式鏡觀察和拍攝，讓深度學(xué)習(xí)軟件對球體的形態(tài)進(jìn)行分析和判別，然后讓顯微操作系統(tǒng)和注射器泵來挑出統(tǒng)一的3D腫瘤細(xì)胞球（從T-47D、5-8F和Huh-7D12三個細(xì)胞系培養(yǎng)而來，培養(yǎng)方案各不相同）并從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到孔板中。他們給這套系統(tǒng)命名為SpheroidPicker。11
Leica S9i體視鏡*的FusionOptics融合光學(xué)系統(tǒng)，可以同時兼顧長景深和高分辨率，而3D球體因?yàn)橛衂軸的深度，所以使用這種技術(shù)可以保證完整而清晰的觀察到球體。且放大倍率可以到55x，實(shí)現(xiàn)9：1的變倍比，實(shí)現(xiàn)總覽到細(xì)節(jié)的快速切換。此外，該機(jī)型搭配了10MP的攝像頭。優(yōu)秀的光學(xué)素質(zhì)和高成像的分辨率可以方便為深度學(xué)習(xí)軟件來分析。再加之有122 mm工作距離，從而有足夠的空間來搭配上圖中的自動化顯微操作系統(tǒng)和注射器。
細(xì)胞球的精確分割是整個細(xì)胞選擇培養(yǎng)流程的重中之重。在自動選擇過程中需要兼顧靈敏性及準(zhǔn)確度問題，以排除尺寸過小、過大或外形不規(guī)則的細(xì)胞球個體。由于細(xì)胞球通常不會彼此接觸或重疊——這一特點(diǎn)恰巧符合U-Net 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)，因此通過U-Net 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的深度學(xué)習(xí)模型可以很好的解決精準(zhǔn)自動地選擇細(xì)胞球這一難題。而同為Leica旗下的Aivia 人工智能圖像分析軟件，是一款具有處理深度學(xué)習(xí)模型的軟件，此外其還為使用者提供了Python 接口，用戶可以調(diào)用公開的三方模型或分析工具，如發(fā)布在GitHub 上的資源，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要編寫符合特定需求的插件，制定一體化的分析流程，提高整體分析流程的效率。
經(jīng)過這套系統(tǒng)轉(zhuǎn)移后的球體狀態(tài)如何呢？作者通過Leica SP8共聚焦檢測了形態(tài)和活力相關(guān)的標(biāo)記物（用calcein AM、Eth-D1和Hoechst3342），通過短時間（轉(zhuǎn)移前后馬上對比）和長時間（0、24、48小時），發(fā)現(xiàn)通過SpheroidPicker的轉(zhuǎn)移操作幾乎不會影響細(xì)胞球的活力。
而這套系統(tǒng)的最終效果如何呢？要求專家和SpheroidPicker挑選面積為21,000-29,000 μm2、最小圓度為0.815的小球。對比最終結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SpheroidPicker對挑選面積和圓度的范圍控制比專家更精準(zhǔn)，其操作28次，其中26個小球被成功挑出，25個轉(zhuǎn)移成功，成功率更高。。
3D球體是現(xiàn)在有前途的體外篩藥模型，讓細(xì)胞XYZ空間展現(xiàn)出較之2D單細(xì)胞層更多更準(zhǔn)確的生理功能，但是其培養(yǎng)方法的不統(tǒng)一造成較難獲得均一化個體，需要后期的挑選才可以作為可信的篩藥對象，而借助能擁有優(yōu)秀光學(xué)素質(zhì)能兼顧清晰和3D景深Leica S9i體視鏡加上深度學(xué)習(xí)軟件（Leica Aivia可以用來開發(fā)此功能），可以自動化的來做挑選和轉(zhuǎn)移的工作，從而讓3D球體成為可信高效的體外篩藥模型。
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