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蛋白質(zhì),你知多少?

閱讀:1210      發(fā)布時(shí)間:2020-3-30
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蛋白質(zhì)圖示

沒有蛋白質(zhì)就沒有生命

可見,蛋白質(zhì)對(duì)人體的重要性。

蛋白質(zhì)是組成人體一切細(xì)胞、組織的重要成分,

機(jī)體所有重要的組成部分都需要有蛋白質(zhì)的參與。

一般說,蛋白質(zhì)約占人體全部質(zhì)量的18%,

重要的還是其與生命現(xiàn)象有關(guān)。

成人每天的蛋白質(zhì)代謝情況

 

人體每天需要從食物中攝取正常值的蛋白質(zhì),

維持身體正常機(jī)制的運(yùn)行。

蛋白質(zhì)常在體液或等滲緩沖液中再懸浮。然而,在這種高導(dǎo)電性溶劑上用電泳光散射(ELS)測(cè)量zeta電位可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生過量熱量,進(jìn)而造成樣品降解和電極損傷。本文中,我們使用穩(wěn)定且可重復(fù)使用的Univette樣品池和Litesizer™500來測(cè)量溶解在等滲緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶菌酶的zeta電位。由于cmPALS技術(shù)和蛋白模式,該模式可以使測(cè)量過程短暫中斷,使樣品冷卻下來,能夠在不造成電極損傷的情況下獲得高重復(fù)性的zeta電位測(cè)量結(jié)果。

簡(jiǎn)介

Zeta電位與粒子間斥力有關(guān),通常表征粒子懸浮液特性必需測(cè)量zeta電位。雖然很多物質(zhì)可以溶解或分散在去離子水中,但有些粒子需要分散在高導(dǎo)電性的溶劑中才能保持其結(jié)構(gòu),不會(huì)降解。這在生物樣品中尤其常見,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、生物醫(yī)學(xué)聚合物和細(xì)胞必須溶解在緩沖液或等滲緩沖液中。

利用電泳光散射(ELS)來測(cè)量zeta電位,這意味著在樣品上應(yīng)用了電場(chǎng)。這種測(cè)量技術(shù)的常見弊端是所謂的焦耳熱,即電流通過導(dǎo)體(樣品)會(huì)產(chǎn)生熱量。樣品的電導(dǎo)率越高,產(chǎn)生的熱量越多,這可能會(huì)導(dǎo)致樣品降解和電極損傷。這個(gè)問題對(duì)于生物樣品來說更為嚴(yán)重,因?yàn)樯飿悠沸枰邔?dǎo)電性的溶劑,并且對(duì)熱解非常敏感。

因此,對(duì)于這樣的樣品,關(guān)鍵是要保持盡可能低的電流,并使用盡可能短的測(cè)試時(shí)間。Anton Paar的Litesizer™500,*的cmPALS技術(shù)可以在較低的電壓和較短的測(cè)量時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定靈敏的zeta電位測(cè)量,從而降低敏感樣品的應(yīng)力。此外,用戶可以激活一個(gè)稱為“蛋白模式”的軟件功能,它會(huì)在測(cè)量zeta電位時(shí)引入短暫的中斷,從而使樣品冷卻下來。

Univette是一種可重復(fù)使用的樣品池,可用于在高導(dǎo)電性或有機(jī)溶劑中測(cè)量zeta電位,它足夠堅(jiān)固,可以承受這種條件,并且不會(huì)造成電極損傷。

本文我們演示了Litesizer™500和Univette的聯(lián)用性能,即使用Kalliope™的蛋白模式來測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶菌酶在高導(dǎo)電性溶劑中的zeta電位。

實(shí)驗(yàn)方法

用卵清蛋白(Sigma-Aldrich)制備了兩種不同的溶菌酶溶液:

  • 0.1 mg/mL,溶于10 mM BisTris 緩沖液 (Carl Roth)和50 mM NaCl (J.T. Baker) 1:1的混合物中。

  • 1.0 mg/mL,溶于磷酸鹽緩沖液(PBS,Sigma-Aldrich)中。

向Univette石英樣品池中加入900 μL樣品。Di一次測(cè)量的平衡時(shí)間設(shè)置為2分鐘,連續(xù)測(cè)量30秒。每個(gè)溶液測(cè)試3個(gè)獨(dú)立樣本,每個(gè)樣本重復(fù)4次,共測(cè)試12次。表1總結(jié)了測(cè)量的輸入?yún)?shù)。

樣品濃度

0.1 mg/ml 

1 mg/ml 

溶劑

10mMBisTris

50mMNaCl (BisTris/NaCl) 

1:1 混合溶液

磷酸緩沖液(PBS)

電壓

5V

3V

運(yùn)行次數(shù)

20

20

重復(fù)次數(shù)

4

4

蛋白模式

表1:實(shí)驗(yàn)設(shè)置

 

Kalliope™軟件中的蛋白模式允許樣品在運(yùn)行時(shí)冷卻,從而減少焦耳熱的影響。

 結(jié)果與討論

在BisTris/NaCl中制備的0.1 mg/mL樣品的平均電導(dǎo)率為6 mS/cm,zeta電位為自動(dòng)測(cè)量模式(表2)。該溶液的平均zeta電位為12 mV,如表2所示,如圖1所示。12次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%。

樣品編號(hào)

平均Zeta 電位[mV]

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[%]

電導(dǎo)率[mS/cm]

1

12.3

3.64

6.069

2

12.1

6.09

6.039

3

12.0

4.38

6.024

1-3

12.1

4.57

6.044

表2:0.1 mg/mL溶菌酶在BisTris/NaCl中溶解的3個(gè)樣品的Zeta電位結(jié)果。每個(gè)值代表4個(gè)測(cè)量值的平均值

 

圖1:0.1 mg/mL溶菌酶在BisTris/NaCl中的zeta電位分布圖

 

PBS配制的1 mg /mL溶液的zeta電位值為9 mV,如表3所示,如圖2所示。然而,該溶液的平均電導(dǎo)率明顯高于BisTris/NaCl (29.4 mS/cm vs. 6 mS/cm)。

盡管如此,測(cè)量值間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是令人滿意的,平均值為7.2%(表3),遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ISO標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的大可接受重復(fù)性10%,這表明ELS不會(huì)導(dǎo)致樣品顯著的降解。

經(jīng)過12次測(cè)量后對(duì)Univette的鈀電極進(jìn)行目測(cè)檢查,也表明這些電極沒有受到任何可見的損傷(未顯示)。

樣品編號(hào)

平均Zeta 電位[mV]

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[%]

電導(dǎo)率[mS/cm]

1

9.5

5.8

30.78

2

8.8

4.4

28.92

3

8.8

9.44

28.50

1-3

9.0

7.19

29.40

表3:溶解于PBS的3個(gè)溶菌酶樣品的Zeta電位結(jié)果。每個(gè)值為4個(gè)測(cè)量值的平均值

 

圖2:PBS中1mg /mL溶菌酶的zeta電位分布圖

結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)中,證明了在高導(dǎo)電性溶劑中使用Litesizer™500和Univette可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高重復(fù)性zeta電位測(cè)量。cmPALS技術(shù)可以在較低的電壓和較短的測(cè)量時(shí)間內(nèi)測(cè)量zeta電位,大大降低了施加在樣品上的應(yīng)力。這使得即使在低濃度(0.1 mg/ml)和高導(dǎo)電性蛋白樣品中也可以進(jìn)行ELS測(cè)量。此外,Kalliope™的蛋白模式在ELS測(cè)試期間限制了焦耳熱,進(jìn)一步有助于樣品和樣品池的保存。

 

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