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在生物制藥領域，對宿主細胞蛋白(HCPs)的精準分析與控制是確保藥物安全與有效性的關鍵環(huán)節(jié)。各國法規(guī)都有關于HCPs的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCPs降低到可接受的水平。

不同監(jiān)管機構(gòu)宿主細胞蛋白(HCPs)法規(guī)要求:

• 《中國藥典》(2020版)三部規(guī)定：針對CHO細胞，HCPs殘留需要<0.05%(相當于小于500ppm)；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。

• 美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCPs，其含量應該低于檢測限(通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCPs含量應小于100ng，也即<0.01%)。

• 歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定：在生物制品中，HCP的含量應當小于0.1%。

• 國際人用藥品注冊技術協(xié)調(diào)會(ICH)指南：ICH Q6B指出，需要根據(jù)ICH準則采用敏感且經(jīng)過驗證的有效方法來監(jiān)控殘留的HCPs，其殘留量通常要求小于100ppm。

• ELISA是各國藥典推薦的在生物制品中檢測殘留HCPs的方法，可以測定HCPs的總量。并且ELISA的操作簡便，是經(jīng)典的免疫學檢測方法。但ELISA檢測HCPs也有方法的局限性，比如不能從ELISA的結(jié)果中知道樣品中有哪些HCPs，或者用于檢測的抗體與哪些HCPs發(fā)生了免疫反應。因此，監(jiān)管部門要求在使用ELISA檢測過程中HCPs殘留含量時，不僅要通過方法學驗證證明試劑盒的準確度，精密度，靈敏度等，而且還需要證明使用的HCPs抗體有廣泛的反應性，即HCPs抗體覆蓋率。
  

圖 1 HCP ELISA試劑盒檢測流程

什么時候做HCPs抗體覆蓋率驗證？

美國藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS將HCPs檢測方法分為：商業(yè)化試劑盒、產(chǎn)品/工藝專屬性方法和平臺化方法。并指出在產(chǎn)品開發(fā)的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCPs的檢測。

USP<1132>提到在沒有平臺化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒；在臨床III期/工藝驗證及產(chǎn)品上市后，由于商業(yè)化的通用HCP檢測試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性，需要考慮結(jié)合細胞類型及工藝特異性等因素，使用平臺化方法或針對上游工藝開發(fā)的產(chǎn)品/工藝專屬性方法。

而在臨床II期后若是需要繼續(xù)使用商品化試劑盒，就需進行HCPs抗體覆蓋率驗證來評估試劑盒是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控。通常推薦在臨床II期末或者臨床三期前的這個階段去做覆蓋率驗證，此時生產(chǎn)工藝已經(jīng)固定并且有相對充足的時間。

圖2 USP<1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測方法的建議

HCP覆蓋率驗證的不同技術路線

傳統(tǒng)的分析方法采用2D Western blot進行覆蓋率驗證，是基于等電點和分子量不同的原理，蛋白在凝膠上通過SDS-PAGE方法被分離。其中一張膠被銀染，另一張被轉(zhuǎn)到PVDF膜上，并結(jié)合ELISA試劑盒中的抗體進行Western Blotting檢測。但因其固有的方法學限制和技術挑戰(zhàn)，往往難以全面、準確地評估多克隆抗體對HCPs的覆蓋范圍。

2D WB方法限制因素：

• 負載能力低

• 樣品經(jīng)過前處理會破壞蛋白天然表位

• HCPs結(jié)合到PVDF膜上導致損失部分檢測到的抗體信息

• 難以將PAGE凝膠與WB圖片對齊

• 特異性差，顯著低估真實抗體覆蓋率

為了克服這一難題，Cygnus Technologies于2014年創(chuàng)新性地推出了抗體親和提取(Antibody Affinity Extraction，AAE™)技術，目的是提高細胞培養(yǎng)收獲液中總HCPs混合物的靈敏度和覆蓋率評估，并可以檢測對下游工藝特異性HCPs的反應性，這些通常也是最為關注的HCPs。與2D-PAGE和2D-WB的靈敏度受負載能力等限制不同，AAE™的靈敏度可高出100倍以上，因為它能夠提取和濃縮大量樣品。

表1 AAE與2D-WB覆蓋率技術路線對比

AAE分析流程首先將多克隆抗體共價固定在色譜柱上。然后對色譜柱進行條件調(diào)節(jié)，以防止抗體的顯著浸出并極大地減少任何非特異性結(jié)合。原始未變性的HCPs樣品通過色譜柱與抗體進行結(jié)合，隨后用酸洗脫。通過結(jié)合和洗脫，HCPs樣品再次在柱上循環(huán)，直到?jīng)]有其他HCPs被結(jié)合。所有收集的HCPs洗脫液再匯集、交換緩沖液并濃縮回原始樣品體積，為后續(xù)的分析提供高質(zhì)量的樣本。在收集到HCPs樣本后，可以選擇通過2D-PAGE+銀染或MS質(zhì)譜進行后續(xù)分析。

圖3 USP<1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測方法的建議

抗體對下游HCPs的反應性和AAE-MS™的HCPs鑒定

  AAE™技術的優(yōu)勢不僅在于其高靈敏度，更在于其強大的預測能力和廣泛的應用前景。通過AAE-MS™獲得的覆蓋率的結(jié)果更高、更真實，可以更準確地預測抗HCPs抗體在ELISA中的表現(xiàn)。并且，AAE™與質(zhì)譜聯(lián)用(AAE-MS™)能夠識別收獲材料中與抗體反應的HCPs，并獲得蛋白質(zhì)的分子量和等電點(pI)信息，可以評估純化過程中持續(xù)存在的單個HCPs，并優(yōu)化下游純化工藝。

圖4 F650S HEK2 93抗體覆蓋率驗證

值得一提的是，AAE™技術在檢測并證明對單個下游HCP的反應性方面表現(xiàn)出色。更主要的是質(zhì)譜可以對樣品中是否存在潛在高風險的HCPs做出鑒定并提供這些蛋白的注釋信息。通過AAE™技術，能夠更準確地識別和量化這些高風險HCPs。這些通過特定純化過程持續(xù)存在的高風險HCPs對于患者安全、藥物功效和穩(wěn)定性至關重要，無論是藥物研發(fā)人員還是監(jiān)管人員都能通過這一技術清楚地了解工藝中某個HCP的殘留情況，從而為藥物的研發(fā)和生產(chǎn)提供強有力的支持。

表2 CHO細胞高風險HCPs

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AAE-MS™在藥物原液和過程樣品監(jiān)控中的應用

AAE-MS™也可以對藥物原液中HCPs富集的同時去除了大部分原料藥。去除原料藥極大地提高了通過2D-PAGE和質(zhì)譜分析識別單個HCPs的能力，因為藥品通常以104-106的倍數(shù)掩蓋HCPs。AAE-MS™是一種更客觀和直接的方法檢測和鑒定原料藥中任何潛在的HCPs雜質(zhì)以幫助優(yōu)化下游純化工藝。

圖5 AAE對藥物原液中HCPs的富集

圖6  AAE-MS™對藥物原液中高風險HCPs的富集和鑒定

總之，抗體親和提取(AAE™)技術以其優(yōu)良性能和廣泛的應用前景，正在逐步成為生物制藥領域HCPs分析的新標準。它不僅能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性，更在靈敏度、預測能力和應用深度上實現(xiàn)了顯著提升。隨著技術的不斷發(fā)展和完善，相信AAE™將在未來為更多藥物的研發(fā)和生產(chǎn)貢獻力量，為患者帶來更加安全、有效的治療方案助力。

支持文獻

[1] USP<1132>Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.

[2] USP<1132.1>Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.

[3] EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.

[4] Host Cell Protein Analysis: Immunoassays and Orthogonal Characterization By Antibody Affinity Extraction and Mass Spectrometry Methods

[5] Antibody Affinity Extraction (AAE™) - A superior alternative to 2D Western blot for determination of polyclonal anti-HCP reactivity.

[6] Antibody Affinity Extraction (AAE™) Empowers HCP Identification by Mass Spectrometry.

Cygnus Technologies專注為生物技術和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測超過50種不同表達系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術應用免疫檢測的高靈敏度分析技術的專家，其產(chǎn)品和服務已經(jīng)被全球超過95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機構(gòu)的廣泛認可。

北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理，與國內(nèi)眾多藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時間，降低QC成本。