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石蠟標(biāo)本切片的制作
點擊次數(shù)：3093 發(fā)布時間：2017-2-7
在制作石蠟組織切片標(biāo)本的實踐中，筆者體會到要做出質(zhì)量好的組織切片標(biāo)本，必須把握制作中的每個環(huán)節(jié)。為確保組織切片標(biāo)本制作的順利進行，現(xiàn)將操作要點介紹如下。
1 取 材
動物處死后，應(yīng)快速取出所需的組織。取材的刀要鋒利，嚴(yán)禁用手或鑷子擠壓，以免損傷組織。切取的組織塊厚度一般為0.5~1.0cm，大小1.5~2.0cm，以免影響固定效果。
2 固 定
固定是將組織塊用化學(xué)試劑浸泡，使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)等成分迅速凝固或沉淀，停止細胞瀕死前或死亡后的變化。同時組織固定后不易變形，有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必須及時固定，固定液的量大約為組織的5倍。常用10%的福爾馬林、zenker氏等固定液。固定時間約為24h。
3 沖 洗
固定好的組織塊需經(jīng)流水沖洗24h，沖洗不*容易造成脫片和染色不佳。對需做免疫組織化學(xué)的組織，更不能忽視這一步驟。
4 脫水和透明
脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來，以利于有機溶劑的滲入。脫水是否*，直接關(guān)系到組織能否充分透明。脫水一般采取上行梯度酒精，從80%酒精、95%酒精至*。還要注意組織在*內(nèi)時間過久，容易發(fā)脆，一般約為4h。組織塊脫水后就進入透明步驟，即經(jīng)過一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)。目前的透明劑是二甲苯，但二甲苯容易使組織發(fā)脆，所以在二甲苯中時間也不宜過長，一般40~60min。
5 浸 蠟
組織透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱為浸蠟。浸蠟溫度過高（超過70℃)，會導(dǎo)致組織發(fā)硬，還會使組織內(nèi)的抗原受到破壞。浸蠟用的石蠟熔點一般在56℃~60℃，浸蠟溫度控制在60℃~70℃。浸蠟時間的長短直接影響組織切片，不同的組織浸蠟時間不同，通常較脆組織如肝、甲狀腺、脾等浸蠟2~3h，含有結(jié)締組織的器官如胃、膀胱、腸等浸蠟時間要延長6h。所用的石蠟如有雜質(zhì)盡可能過濾，以防附著在組織上，影響切片與觀察。
6 包 埋
用包埋劑來支持組織的過程稱為包埋。zui常用的是石蠟包埋法。包埋的關(guān)鍵是平整和方位。包埋時，要求用鑷子輕壓組織塊拱起部份，使之平貼于底部，通常采用組織的zui大面包埋；囊壁、管腔組織應(yīng)豎直包埋。修去兩邊的余蠟（指切片時與切片刀垂直的兩側(cè)）。
7 切 片
切片的*步需粗切。粗切的厚度20~40μm，粗切至組織全部暴露后，再進行細切。細切至組織塊表面均勻一致，無白點。切片時要求用力均勻、柔和，切片厚度一般為3~5μm，切下的蠟?zāi)ご笮?、形狀?yīng)與組織塊上的組織大小形狀一致。如氣溫較高，石蠟組織塊較軟可用冰塊局部冰凍（操作狀態(tài)下），使組織塊變硬便于做連續(xù)性切片；如氣溫較低、石蠟組織塊較硬時可用大拇指熱敷或用嘴吹氣加溫，使組織塊變軟再做連續(xù)性切片。
8 展片與撈片
把切片放入溫水中展開即為展片。展片水溫應(yīng)在48℃~55℃，這主要和包埋蠟的熔點有關(guān)：水溫過高，會引起組織細胞散開；水溫過低，切片皺摺無法攤平。展開片子上的皺摺，有兩個方法：①在切片時邊切邊向蠟片吹氣，這樣片子放到熱水里會自然展平；②切片結(jié)束后，先把切片放在30%酒精水溶液中，讓酒精的張力自動把皺摺展開，然后再將切片移到熱水中，酒精濃度不宜過高，否則容易引起切片破碎，出現(xiàn)裂隙。脂肪類組織遇到酒精會散開，故不能用此法。撈片時，要選擇那些完整、無皺摺的切片，粘貼于載玻片上。
9 烤片和脫蠟
烤片是烤干切片上多余的水分和石蠟，并使切片與載玻片牢固粘貼。一般在60℃的溫箱內(nèi)進行，溫度過高，會引起切片的組織細胞收縮；時間太短（少于20min），容易造成脫片。脫蠟也相當(dāng)重要，如果脫蠟不干凈，切片不易著色或著色不勻。所以在脫蠟過程中，脫蠟劑（松節(jié)油）要常更換（用15~20次）?？酒Y(jié)束后立即將切片放在溫箱內(nèi)預(yù)熱（40℃~45℃）的松節(jié)油Ⅰ、Ⅱ中15min，然后經(jīng)下行梯度酒精洗去松節(jié)油至水。
10 染 色
按常規(guī)的HE染色。染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是細胞核與細胞質(zhì)藍紅相映，色澤鮮艷，核漿對比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見。
11 脫水和封片
切片脫水采用上行梯度酒精。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水，但也容易使伊紅退色，故脫水時間要短（1~2min），也可無須用酒精脫水而直接晾干。切片經(jīng)二甲苯透明。用中性樹膠封片，一定要避免氣泡的產(chǎn)生。