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細胞的凍存與復蘇
點擊次數(shù)：843 發(fā)布時間：2015-7-17
凍存溫度
冷凍速度也就是降溫的速度，它與冷凍效果直接相關。
Morris認為在冷凍過程中生物物理作用比生物化學作用更重要。冷凍速度、細胞收縮引起細胞膜和細胞器的變化是造成損傷的主要因素目。冷凍速度不同，細胞內水分向細胞外流動的情況也會不同。如果冷凍速度過慢，細胞內水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，同時細胞內溶質濃度增高，細胞內不發(fā)生結冰；冷凍速度過快，細胞內水分沒有足夠時間外滲，隨著溫度的下降，細胞內會發(fā)生結冰；如果冷凍速度非?？?，細胞內形成的冰晶反而非常小或不結冰而呈玻璃狀凝固(玻璃化冷凍)。
1937年，Luyet證實液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，液體中的分子呈有序的排列；另一種為非晶體化即玻璃化，液體中的分子呈無序排列，保持未凝固前的狀態(tài)。故從細胞存活角度來說玻璃化冷凍是zui為理想的凍存方法。細胞內外呈玻璃化凝固。無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不造成破壞；細胞也不會在高濃度溶質的溶液中因暴露時間過長而受損。
不同細胞的zui適冷凍速度不同，主要取決于水分滲透過程是否與降溫速度相匹配；同時還取決于細胞的表面積與體積之比，以及細胞膜的滲透率。一般來說。小細胞(如紅細胞等)對水通透性強，適用于快凍，*冷凍速率較高，可達103攝氏度/min或更高；相反大的細胞或組織，如直徑100μm以上的胚胎，對水的通透性弱，則適于慢凍。
此外，*冷凍速度還受是否應用防凍劑、防凍劑的含量以及培養(yǎng)的細胞所處的狀態(tài)等多方面的因素影響。目前被普遍接受的是皮膚的低溫保存中采用慢凍快復溫，一般認為降溫速率以1~5攝氏度/min為*。
保存溫度：
冷凍保存溫度是指長久保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應極其緩慢甚至停止。經(jīng)過長期保存的細胞和組織在復蘇后仍能保存正常的結構和功能。
冷凍保存溫度可以隨著不同的細胞和生物體以及不同的冷凍保存方法而不同。液氮溫度(-196℃)是目前*冷凍保存溫度。在-196℃時，細胞生命活動幾乎停止，但復蘇后細胞結構和功能完好。應用-70~80℃條件冷凍保存細胞，短期內對細胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在0～40℃范圍內保存細胞效果不佳。
細胞復蘇：
復溫速度是指在細胞復蘇時溫度升高的速度。冷凍保存體外培養(yǎng)物，除了必須有*的冷凍速度、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復蘇時也需要有*的復溫速度，這樣才能保證zui終得*冷凍保存效果。與冷凍過程相比，復溫過程的研究顯得薄弱得多。
復溫速度不當同樣會造成細胞損傷，降低凍存細胞存活率。其損傷發(fā)生非?？欤掷m(xù)時間也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通過對酵母細胞的冷凍研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中胞內形成的冰晶并未對細胞造成致命的損傷，反而是在復溫過程中，復溫到-40℃或者更高的溫度時，細胞內會重新形成較大冰晶而造成細胞的致命損傷。常規(guī)的做法是，在37℃水浴中，于1—2 min內完成復溫，也就是通常采用的快速復蘇。
因此，*復溫速率與*冷凍速率對保證獲得*凍存效果同等重要。
凍存保護劑：
凍存保護劑(Cryoprotectant)是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(常為溶液)。細胞懸液中加入冷凍保護劑可保護細胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑同溶液中的水分子結合，發(fā)生水合作用，弱化水的結晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成．同時冷凍保護劑可以通過在細胞內外維持一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的損傷。
冷凍保護劑根據(jù)其是否穿透細胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。
滲透性冷凍保護劑多是一些小分子物質，可以透過細胞膜滲透到細胞內。該類保護劑主要包括二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液*凝固之前，滲透到細胞內，在細胞內外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷同時。細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定時間進行預冷，在細胞內外達到平衡以起到充分的保護作用。目前使用較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。
非滲透性冷凍保護劑一般是些大分子物質，不能滲透到細胞內。
不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)缺點。目前的趨勢是聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護劑組合。由于許多冷凍保護劑在低溫條件下保護細胞，在常溫下對細胞有害。故在細胞復溫后要及時清除冷凍保護劑。