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細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
點擊次數(shù)：883 發(fā)布時間：2015-7-17
凍存溫度
冷凍速度也就是降溫的速度，它與冷凍效果直接相關(guān)。
Morris認(rèn)為在冷凍過程中生物物理作用比生物化學(xué)作用更重要。冷凍速度、細(xì)胞收縮引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器的變化是造成損傷的主要因素目。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動的情況也會不同。如果冷凍速度過慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，同時細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰；冷凍速度過快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠時間外滲，隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度非常快，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶反而非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固(玻璃化冷凍)。
1937年，Luyet證實液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，液體中的分子呈有序的排列；另一種為非晶體化即玻璃化，液體中的分子呈無序排列，保持未凝固前的狀態(tài)。故從細(xì)胞存活角度來說玻璃化冷凍是zui為理想的凍存方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固。無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞；細(xì)胞也不會在高濃度溶質(zhì)的溶液中因暴露時間過長而受損。
不同細(xì)胞的zui適冷凍速度不同，主要取決于水分滲透過程是否與降溫速度相匹配；同時還取決于細(xì)胞的表面積與體積之比，以及細(xì)胞膜的滲透率。一般來說。小細(xì)胞(如紅細(xì)胞等)對水通透性強(qiáng)，適用于快凍，*冷凍速率較高，可達(dá)103攝氏度/min或更高；相反大的細(xì)胞或組織，如直徑100μm以上的胚胎，對水的通透性弱，則適于慢凍。
此外，*冷凍速度還受是否應(yīng)用防凍劑、防凍劑的含量以及培養(yǎng)的細(xì)胞所處的狀態(tài)等多方面的因素影響。目前被普遍接受的是皮膚的低溫保存中采用慢凍快復(fù)溫，一般認(rèn)為降溫速率以1~5攝氏度/min為*。
保存溫度：
冷凍保存溫度是指長久保存細(xì)胞的超低溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止。經(jīng)過長期保存的細(xì)胞和組織在復(fù)蘇后仍能保存正常的結(jié)構(gòu)和功能。
冷凍保存溫度可以隨著不同的細(xì)胞和生物體以及不同的冷凍保存方法而不同。液氮溫度(-196℃)是目前*冷凍保存溫度。在-196℃時，細(xì)胞生命活動幾乎停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完好。應(yīng)用-70~80℃條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯降低。在0～40℃范圍內(nèi)保存細(xì)胞效果不佳。
細(xì)胞復(fù)蘇：
復(fù)溫速度是指在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。冷凍保存體外培養(yǎng)物，除了必須有*的冷凍速度、合適的冷凍保護(hù)劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時也需要有*的復(fù)溫速度，這樣才能保證zui終得*冷凍保存效果。與冷凍過程相比，復(fù)溫過程的研究顯得薄弱得多。
復(fù)溫速度不當(dāng)同樣會造成細(xì)胞損傷，降低凍存細(xì)胞存活率。其損傷發(fā)生非?？?，持續(xù)時間也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通過對酵母細(xì)胞的冷凍研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中胞內(nèi)形成的冰晶并未對細(xì)胞造成致命的損傷，反而是在復(fù)溫過程中，復(fù)溫到-40℃或者更高的溫度時，細(xì)胞內(nèi)會重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞的致命損傷。常規(guī)的做法是，在37℃水浴中，于1—2 min內(nèi)完成復(fù)溫，也就是通常采用的快速復(fù)蘇。
因此，*復(fù)溫速率與*冷凍速率對保證獲得*凍存效果同等重要。
凍存保護(hù)劑：
凍存保護(hù)劑(Cryoprotectant)是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)(常為溶液)。細(xì)胞懸液中加入冷凍保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護(hù)劑同溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成．同時冷凍保護(hù)劑可以通過在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷。
冷凍保護(hù)劑根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。
滲透性冷凍保護(hù)劑多是一些小分子物質(zhì)，可以透過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)。該類保護(hù)劑主要包括二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液*凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷同時。細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定時間進(jìn)行預(yù)冷，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前使用較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。
非滲透性冷凍保護(hù)劑一般是些大分子物質(zhì)，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)。
不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)缺點。目前的趨勢是聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組合。由于許多冷凍保護(hù)劑在低溫條件下保護(hù)細(xì)胞，在常溫下對細(xì)胞有害。故在細(xì)胞復(fù)溫后要及時清除冷凍保護(hù)劑。