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基因片段表達作圖法
閱讀：942 發(fā)布時間：2010-11-24 已有許多方法，包括已商品化的試劑盒（Novatope），被用來在一個表達載體系統(tǒng)中進行隨機的或特定的開放閱讀框基因片段的表達。然后測定基因片段庫與特定抗體的反應(yīng)性，并進行作圖。與抗體結(jié)合的基因片段序列特性，可以通過測序分析證實。在許多實驗中，研究者可事先將所研究的基因片段庫克隆在表達載體中。其中的基因片段可能是不完整的cDNA片段，所有這些片段均可以通過簡單的免疫化學方法鑒定其中是否存在有相關(guān)的抗原表位。如果抗體與目的抗原在免疫印跡中具有較強的反應(yīng)，說明可采用同樣的方法分析任一表達的基因片段。
如果某些抗體在免疫印跡試驗中與基因片段編碼的蛋白質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，仍然可以將此類抗體標記后對細菌克隆直接進行印跡分析。例如，在直接印跡分析中，所有針對SV40大T抗原的單克隆抗體與基因片段編碼的蛋白質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，但仍然可以通過測定其與p—半乳糖苷酶的融合蛋白反應(yīng)進行表位作圖。因此，許多容易變性的抗原表位可以用此法進行作圖。
如果在一個表達載體中沒有建立基因片段的文庫。那么，表位作圖時建立基因文庫是首要目標。對此建議選擇一種快速、簡單、適用的方法，且不必進一步克隆和測序；而且有機會對易變性的蛋白表位作圖，至少是部分作圖。
一個的選擇是基于PCR表達原理，因為設(shè)計的PCR產(chǎn)物在體外可有效表達，并與有關(guān)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的關(guān)鍵DNA調(diào)節(jié)原件相協(xié)調(diào)。為了檢查人類基因性疾病，如APC和BRCA2，已廣泛使用檢測影響蛋白質(zhì)合成的截斷性突變。亦有許多，其關(guān)鍵的試劑盒也可獲得。
采用PCR產(chǎn)物表達方法可以擴增一系列的已經(jīng)確定的基因片段，并可以進一步利用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯試劑盒將其在體外表達。此法并不需要在原來克隆基礎(chǔ)上進行亞克隆，因為PCR產(chǎn)物本身可以作為轉(zhuǎn)錄和翻譯的模板在體外進行表達。但是，這也意味著PCR過程中所產(chǎn)生的序列錯誤將不可能在克隆過程中排除。體外翻譯過程中對蛋白產(chǎn)物進行標記，有助于采用直接免疫沉淀法分析與抗體反應(yīng)的片段。
該方法的目的是利用PCR產(chǎn)生一系列線性DNA片段，其中包括體外轉(zhuǎn)錄所必需的啟動子和體外翻譯過程所必需的各類調(diào)節(jié)信號。這些DNA片段實際包括了原始基因開放閱讀框的氨基和羧基末端重疊的基因片段序列。這些線狀DNA產(chǎn)物可以直接作為模板在體外進行翻譯表達。利用放射性標記的氨基酸摻入體外翻譯反應(yīng)，可以用免疫沉淀方法對蛋白質(zhì)進行鑒定和分析。較之分析前須對每一產(chǎn)物進行克隆的表達方法，該方法有其顯著的優(yōu)點。在這種方法中，蛋白質(zhì)體外翻譯所產(chǎn)生的是可溶性蛋白，而且其折疊形式是與自然狀態(tài)相一致。
蛋白質(zhì)片段的羧基末端產(chǎn)生很容易，因為，這里不需要對蛋白的氨基末端或啟動子元件進行任何的修飾，5，端引物應(yīng)保證PCR產(chǎn)物含有完整的啟動子元件。相反，3，端反義引物系列將決定蛋白質(zhì)片段新的末端。
從氨基末端產(chǎn)生一系列蛋白片段則較困難，因為必需保留蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中所涉及的5’端各類啟動子和翻譯信號。要保證體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，可以采用通用的啟動子元件，其中含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的信號，如RNA聚合酶結(jié)合位點，不翻譯的前導(dǎo)信號序列，Kozak序列和翻譯起始密碼子。這些通用啟動元件可以和任何一種開放閱讀框結(jié)合，這些PCR產(chǎn)物可用一種技術(shù)將相互末端重疊的DNA片段進行拼接，此法也稱為重疊延伸拼接法（splicingby overlap extension，SOE）。這種拼接反應(yīng)可以產(chǎn)生一種融合產(chǎn)物，將體外轉(zhuǎn)錄和翻譯過程所需的所有元件都包括在內(nèi)，使得轉(zhuǎn)錄和翻譯可在開放閱讀框中選擇特定位點進行（Kain et a1．1991；Burch et a1．1993；Tropak and Roder1994；FarlyandLong 1995）。
35S甲硫氨酸標記的翻譯產(chǎn)物，可以用免疫沉淀和凝膠電泳進行分析。
對任何表位作圖的結(jié)果分析，僅選用陽性反應(yīng)的蛋白片段進行預(yù)測。缺少與特定蛋白片段陽性反應(yīng)，并不能說明該表位不包括在蛋白片段內(nèi)，因為，蛋白質(zhì)局部的折疊可能使表位被掩蓋。雖然這是在對某些構(gòu)象依賴性表位作圖時常遇到的問題，但在所有情況下都應(yīng)該遵守這個原則。
如果由于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的表達試劑盒花費太大，或者因為使用同位素受到限制，另外一種可選擇的方法是采用PCR方法將一段已知片段的開放閱讀框克隆至一種簡單的、但是能夠表達的細菌表達載體中。使用能夠使表達片段產(chǎn)生基因融合的載體，如含有谷胱甘肽S—轉(zhuǎn)移酶（GST）基因、或者p—半乳糖苷酶基因的載體。上述2種載體均能產(chǎn)生大量的融合蛋白，而且，載體中含有合適的限制性酶切位點。這些酶切位點可以在調(diào)整表達片段開放閱讀框時，配合PCR引物序列進行有效的調(diào)節(jié)。這些融合蛋白可以直接使用表達融合蛋白的細菌進行克隆，或者以該細菌細胞提取液進行蛋白免疫印跡法檢測。