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般注意事項(xiàng)：
閱讀：411 發(fā)布時(shí)間：2010-12-9- 當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時(shí)，首先檢查以下幾方面并遵照?qǐng)?zhí)行：
- 將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。
- 當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動(dòng)”開始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。
- 不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。
- 對(duì)于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。
- 沒有擴(kuò)增產(chǎn)物：
- 在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。
- 泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。
- 檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
- 檢查模板和引物的用量。
- 增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。
- 泳道中出現(xiàn)模糊條帶：
- 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。
- 提高退火溫度，但不要超過68℃。
- 重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長的引物。
- 其他值得注意的條件：
- 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時(shí)不能有效地使模板變性。
- *反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的PCR儀可以不加）。
- 大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。
- 建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到*結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。
- 基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。
- 要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請(qǐng)查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。
- 降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長度一般為24~34個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。
- 變性：*步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時(shí)間（94℃下進(jìn)行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。
- 延伸：68--72℃下進(jìn)行延伸操作。
- 循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來的8分鐘。
- 長片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個(gè)突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。
- 測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。
- 引物設(shè)計(jì)：
- 一般長度20-30bp；
- 至少50%的GC含量；
- 避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)；
- 引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。
也可下列圖示提示找到解決問題的突破口：
