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cDNA產(chǎn)量的很低

A: RNA模板質(zhì)量低

B: 對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高

C: 反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足

D: 反應(yīng)體積過(guò)大

2.  擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺

A: zui常見(jiàn)的原因在于反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
　　 B: 與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
　　 C: 建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA
　　 D: *鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10
　　 E: 建議用Oligo（dT）或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反 轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決.
　　 a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
　　 b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo（dT）進(jìn)行*鏈反應(yīng)

3.   產(chǎn)生非特異性條帶

A: 用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

B: 在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

C: 由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

4.  產(chǎn)生彌散（smear）條帶

          A: 在PCR反應(yīng)體系中*鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高
　　 B: 減少引物的用量
　　 C: 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
　　 D: 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。

5.  產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6.  在無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果

A: 通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將*鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

B: 有可能是引物二聚體的條帶

7. 擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

A: 有可能是由于模板量過(guò)高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。B: 建議將*鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。
C: 另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

8. 為什么使用基因特異性引物（GSP）？

GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。

9. 什么情況下需要使用RNase H？

在*輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)10. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：

目的	建議
RT與PCR使用不同的引物 或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶	兩步法RT-PCR系統(tǒng)
高靈敏度	一步法或兩步法系統(tǒng)
高特異性	含有適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的兩步法系統(tǒng) 或具有高保真Platinum Taq酶的一步法系統(tǒng)
高保真度	含有Pfx Taq酶的兩步法系統(tǒng)
長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果	通常使用兩步法系統(tǒng)可達(dá)到*結(jié)果 含Elongase酶的一步法系統(tǒng)

 

 

RACE

1.如何設(shè)計(jì)基因特異性引物（GSP）？

使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：
　　 A: 50-70％的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)（Tm）
　　 B: 23-28個(gè)堿基長(zhǎng)度，以提高引物特異性
　　 C: 降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至zui低

2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物？

A: 加入Hela對(duì)照

B: 低質(zhì)量的RNA模板
　　 C: 逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(zhǎng)模板cDNA的合成
　　 D: 目的基因豐度太低，可以通過(guò)提高PCR的循環(huán)次數(shù)來(lái)解決，建議使用巢式PCR
　　 E: 目的基因沒(méi)有表達(dá)，可以通過(guò)使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因
　　 F: 目的基因太長(zhǎng)而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用Oligo dT來(lái)得到全長(zhǎng)cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。
　　 G: cDNA模板屬于困難模板，可以通過(guò)以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過(guò)高GC含量區(qū)；使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。

3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶

RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
　　 A: GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。
　　 B: 引物和cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有引物序列的PCR產(chǎn)物。
　　 C: RNA降解。
　　 D: PCR管或試劑污染。
　　注意：雜帶一般是因?yàn)闆](méi)有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對(duì)照來(lái)確定。

4. 得不到全長(zhǎng)的5’RACE PCR產(chǎn)物

A: CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同RACE RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。

B: CIP脫磷酸不*，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量.

C: PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。