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藥品試劑：

經(jīng)BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31

含EtBr 的1.2% 12-well agarose gel

1×TAE 電泳緩沖液

QIAquick Gel Extraction Kit （Qiagen），內(nèi)含：

QIAquick spin column （管柱底部為silica gel membrane）

Buffer QG

Buffer PE

Buffer EB （10 mM Tris-HCl, pH 8.5）

2 mL 收集管

TE-8.0

 

方法步驟：

1） 經(jīng)BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31，置于65℃水浴10 min，移

至冰浴降溫后，以含EtBr 的1.0% agarose gel 進(jìn)行電泳 （兩種樣品各用六個(gè)wells，每個(gè)well 注入30 μL 樣品）。

2） 電泳后以長(zhǎng)波長(zhǎng)UV 燈觀察DNA 片段所在位置，并以干凈刀片將GUS 及pQE31 片段切下，請(qǐng)盡可能去除周?chē)嘤嗟哪z體。

3） 取數(shù)個(gè)微量離心管，分別稱重并記錄重量后，將膠體置于管中再稱重，估計(jì)膠體重量。

◆ 注意! 每管膠體不可超過(guò)400 mg。

4） 于離心管中加入Buffer QG，加入比例為： 每100 mg 膠體加入0.4 mL BufferQG。

◆ Buffer QG 中含有g(shù)uanidine hydrochloride，會(huì)對(duì)皮膚及眼睛造成傷害，請(qǐng)小心使用。

5） 置50℃水浴中15 min，每隔 2~3 min 以手指輕彈管壁促進(jìn)膠體溶解。如果膠體尚未溶解*，則延長(zhǎng)5~10 min，務(wù)使膠體*溶解。

6） 待膠體*溶解后，檢查溶液顏色是否為黃色 （應(yīng)與Buffer QG 相近），若顏色為橘色或紫色，表示pH 值不恰當(dāng)，請(qǐng)加入10 μL NaOAc （3 M, pH 5.0），混合均勻后，再檢查溶液的顏色。

◆ 膠體溶液的pH 值必須≦7.5，若大于7.5，會(huì)造成DNA 與silica-gelmembrane 間的吸附效率驟降。此組套的Buffer QG 中含有pH 指示劑，若pH≦7.5，溶液顏色應(yīng)呈黃色。

7） 將spin column 置于2 mL 收集管中，加入上述*溶解的膠體溶液，以12,000rpm 離心1 min。

◆ 每個(gè)QIAquick spin column 只能裝約0.8 mL 溶液，所以請(qǐng)分多次離心，每次離心完需將下方收集管內(nèi)的收集液倒掉。

◆ 若 DNA 片段小于500 bp 或大于4 kb，可于膠體溶液中加入1 倍體積的isopropanol，混合均勻后，再加入spin column 中離心，以提高DNA 回收效率。

8） 將spin column 置回收集管上，加入0.5 mL Buffer QG，再以12,000 rpm 離心1 min，以去除殘存的agarose 膠體。

9） 離心后，倒掉收集管中的溶液。將spin column 置回收集管上，在spin column中加入0.75 mL Buffer PE，于室溫靜置2~5 min 后，以12,000 rpm 離心1 min，并去除收集管中的溶液。

10） 將spin column 置回收集管中，再于13,000 rpm 離心1 min，以*去除spincolumn 中殘留的Buffer PE

◆ Buffer PE 中含有酒精，必須*去除，否則易干擾后續(xù)酶反應(yīng)。

11） 將spin column 置于干凈的1.5 mL 微量離心管中。將30 μL 溶離緩沖液（Buffer EB） 加在silica membrane 上，靜置1~5 min，以將吸附于膜上的DNA*溶離出。

◆ 溶離緩沖液的pH 值需在7.0~8.5 間，才能達(dá)到*溶離效果。也可以用TE-8.0 或水作為溶離液，但使用TE-8.0 時(shí)，需考慮EDTA 是否對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有影響；使用水進(jìn)行溶離時(shí)，則需注意水的pH 值，及溶離DNA 的保存 （DNA 在水中并不不穩(wěn)定）。

12） 以12,000 rpm 離心2 min。收集微量離心管中含有DNA 的溶離液，并進(jìn)行DNA 的定量及接合反應(yīng)。