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熒光顯微鏡的原理部件及激發(fā)方式
閱讀：764 發(fā)布時(shí)間：2011-5-27熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同，它不是通過(guò)普通光源的照明觀察標(biāo)本，而是利用一定波長(zhǎng)的光（通常是紫外光、藍(lán)紫光）激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)，使之發(fā)射熒光，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為一種激發(fā)標(biāo)本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。我們之所以能觀察標(biāo)本，是由于光源的照明，而是標(biāo)本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。
由此可知，熒光顯微鏡的特點(diǎn)，主要是它的光源能供給大量特定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強(qiáng)度的激發(fā)光。同時(shí)，熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng)。
熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)（包括激發(fā)和壓制濾板）、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成（圖3—12），是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。
激發(fā)熒光的方式：按光的波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法（使用紫外線照明法）和BV激發(fā)法（使用藍(lán)紫光）兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見(jiàn)的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。
BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可*阻斷藍(lán)光并可充分通過(guò)所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對(duì)于激發(fā)光的極大吸收波長(zhǎng)和熒光的極大發(fā)光波長(zhǎng)比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。其缺點(diǎn)是500nm以下的熒光無(wú)法看到，而500nm以上的使整個(gè)圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素*的顏色來(lái)判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時(shí)，上述BV激發(fā)法的缺點(diǎn)往往影響極大。
綜上所述，熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長(zhǎng)按以下三點(diǎn)考慮。
①?gòu)臒晒庀竦姆床钜髞?lái)看，UV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明。
②以像的亮度來(lái)考慮，BV激發(fā)濾光片暗場(chǎng)觀察效率zui高。
③UV激發(fā)濾光片暗場(chǎng)觀察和BV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明的特性，可看作介于這兩種照明方法之間，但前者濾光片暗場(chǎng)的性質(zhì)較強(qiáng)，顯示圖像較明亮，反差小；后者因保留暗場(chǎng)光路的性質(zhì)，故顯示圖像較暗，而反差有所改善。當(dāng)實(shí)際使用熒光顯微鏡時(shí)，應(yīng)采用標(biāo)本要求的照明法進(jìn)行觀察。
必須指出，即使像反差*的UV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明，由標(biāo)本折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會(huì)進(jìn)入物鏡，這樣在光學(xué)系統(tǒng)中的加拿大膠膠合面和光學(xué)玻璃因激發(fā)引起的自身熒光會(huì)使像的反應(yīng)變壞。因此，必須在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片。