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轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（TGF-α）的測(cè)定
閱讀：1580 發(fā)布時(shí)間：2011-12-17轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）的結(jié)構(gòu)和功能與TGF相似，屬EGF家族。檢測(cè)EGF生物學(xué)活性的方法也可以檢測(cè)TGF-α的活性。此外，EGF能誘導(dǎo)3T3小鼠的J2細(xì)胞合成DNA，TGF-α與EGF競(jìng)爭(zhēng)受體，抑制EGF的作用，故可通過(guò)抑制EGF誘導(dǎo)的DNA合成試驗(yàn)檢測(cè)TGF-α的活性。
1．將3T3J2細(xì)胞培養(yǎng)在含0．5％FCS的DMEM培養(yǎng)液中，用0．25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，并配成6×104／mL。
2．于24孔培養(yǎng)板每孔加入0．5mL細(xì)胞懸液，用細(xì)胞培養(yǎng)液作系列稀釋的TGF-a待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)晶0．5mL、1nmol／LEGF和luCi（37kBp）3H-TdR，并設(shè)置單加EGF的陽(yáng)性對(duì)照和高劑量TGF-a陰性對(duì)照，均設(shè)3復(fù)孔，總反應(yīng)體積為lmL。
3．置37~C 5％C02溫箱中培養(yǎng)72h。用PBS洗3次，每孔加入5％三氯醋酸lmL沉淀DNA，再用甲醇洗孔1次，離心去甲醇溶液。加入lmLlmol／LNaOH，溶解細(xì)胞。將各孔細(xì)胞吸人閃爍液瓶中，在p-計(jì)數(shù)儀上測(cè)定各孔的cpm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中的TGF-a含量（活性）。