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淋巴母細(xì)胞增殖法檢測(cè)IL—12
閱讀：379 發(fā)布時(shí)間：2012-4-21本法利用IL-12促進(jìn)PHA激活的人淋巴母細(xì)胞增殖來測(cè)定IL-12含量，這是目前定量測(cè)定IL-12的方法，操作亦較簡(jiǎn)單，但因IL-2、IL-4和IL-7亦可促進(jìn)PHA激活的淋巴母細(xì)胞增殖，故此法不宜用于可能含多種細(xì)胞因子標(biāo)本的測(cè)定。
1．用*培養(yǎng)液稀釋人或鼠IL-12標(biāo)準(zhǔn)品分別至2ng／mL和4nz／mL，然后進(jìn)行5倍系列稀釋共3個(gè)稀釋度。
2．系列稀釋待檢標(biāo)本，使其IL-12濃度大致處于2—20ng／mL范圍。
3．向96孔板加PHA激活的人淋巴母細(xì)胞50uL／孔（終濃度2X104／mL）。
4．加40ul待檢標(biāo)本和各稀釋度IL-12標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，zui后3孔加*培養(yǎng)液50ul作為對(duì)照（無II．-12），培養(yǎng)24h。
5．加3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)18h，收獲細(xì)胞，計(jì)算IL-12含量。
[附]：PHA激活的人淋巴母細(xì)胞制備：
①取正常供者外周血，常規(guī)方法分離PBMC；
②在5mL*培養(yǎng)液中懸浮PBMC，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞；
③接種于75cm2培養(yǎng)瓶，20mL液體中的細(xì)胞數(shù)為1X107，加20／uL PHA混勻后，水平培養(yǎng)3d；
④加20mL培養(yǎng)液，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞?昆勻，轉(zhuǎn)移20mL內(nèi)容物至另一培養(yǎng)瓶；
⑤加人rh-IL-2至終濃度為50U／mL，孵育24h；
⑥將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至15mL離心管，室溫下1 500r／min，離心5min，除去上清；
⑦用培養(yǎng)液同上離心洗3次，所得細(xì)胞即為淋巴母細(xì)胞。