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過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物的制備
閱讀：518 發(fā)布時間：2012-6-2試劑及配制
1. HRP和兔（或羊）抗HRP：抗HRP用HRP免疫兔（或羊）獲得。
2. 0.075mol/L醋酸鈉-0.15 mol/L醋酸銨等量混合液
3. 0.1mol/LHCl和0.01mol/LHCl
4. 飽和硫酸銨溶液
5. 0.01mol/L NaOH
操作方法
1. 取兔（或羊）抗HRP血清5ml，16000r/min離心20min，去沉淀；
2. 于收集的上清中加入HRP（2mg/ml）溶液1ml，室溫緩慢攪拌1h，同上離心；
3. 沉淀物用冷生理鹽水洗滌3次，棄上清；
4. 于沉淀中加入HRP（2mg/ml）溶液4ml，混勻后，移至小燒杯；
5. 邊攪拌邊加入0.1mol/LHCl（約10滴），再用0.01mol/LHCl調(diào)pH值至2.4左右；
6. 待沉淀*溶解，溶液變清時，立即加入0.01mol/LNaOH將pH值調(diào)回7.4；
7. 同上離心，去沉淀；
8. 于收集的上清中加入1/10體積的0.075mol/L醋酸鈉-0.15 mol/L醋酸銨等量混合液，混勻；
9. 在電磁攪拌下逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，并繼續(xù)攪拌10min后，放4℃20min；
10. 同上離心，去上清，再用等量飽和硫酸銨溶液洗滌離心2次；
11. 將沉淀物溶于5ml生理鹽水，并裝入透析袋；
12. 用ph6.75醋酸鹽緩沖液（13.5L生理鹽水、1.5L蒸餾水、75ml 1.5 mol/L醋酸鈉及75ml 3mol/L醋酸銨） 4℃透析3天，每天換液2次；
13. 同上離心，取上清進行鑒定。然后加等量60%甘油，小量分裝，-20℃保存。
注意事項
1. 制備PAP時應預先選擇HRP與抗HRP的等價帶。
2. 應用抗HRP McAb制備PAP時，方法較為簡單。據(jù)程明報道，用小鼠抗HRP McAb的腹水，按一定的HRP/IgG摩爾比（以4：1為宜）混合，置37℃水浴2h，即成鼠PAP復合物。而且由于抗HRP McAb與HRP形成的復合物均為可溶性的，因此不必加入過量的酶量。