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細胞因子mRNA表達的檢測
閱讀：1847 發(fā)布時間：2012-6-30常用的方法有Northern印跡雜交，斑點印跡雜交，RT-PCR，原位雜交與原位PCR，RNA半壽期的檢測，進行中的轉(zhuǎn)錄分析（run。nassay）等。
（一）Northern印跡雜交
將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物（如尼龍膜）上，再用某一細胞因子的標(biāo)記核酸探針雜交，以檢測相應(yīng)細胞因子mRNA的分子量及其在細胞內(nèi)的積累量。
細胞因子大都是在某種刺激因素的影響下，使其mRNA轉(zhuǎn)錄活性增強，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)mRNA積累增加。但用細胞總RNA作Northern印跡雜交，其結(jié)果不能*反映mRNA的轉(zhuǎn)錄活性，因為mRNA的穩(wěn)定性及其降解速率直接影響細胞內(nèi)mRNA的積累量。
（二）斑點及狹縫印跡雜交
原理同上。只是用RNA替代DNA點樣在膜上，其變性方法與DNA不同。
（三）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）
細胞因子的mRNA壽命短且拷貝數(shù)低，因此難以在小量樣本中進行檢測。RT-PCR是一種能檢測細胞內(nèi)低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成與RNA互補的cDNA。然后以cDNA為模板，用PCR技術(shù)對靶序列進行擴增，使微量細胞因子的RNA經(jīng)放大后檢出。RT-PCR能檢出單個細胞中少于10個拷貝的特異RNA，如同時放大內(nèi)參照物，即可對RT-PCR檢出的細胞因子mRNA進行定量。
（四）原位雜交及原位RT-PCR
原位雜交的原理基本同上，僅是在組織細胞切片上，用標(biāo)記的核酸探針檢測胞漿內(nèi)的特異mRNA；而檢測細胞內(nèi)低拷貝mRNA的方法則用原位反轉(zhuǎn)錄PCR。
（五）mRNA半壽期的測定
mRNA半壽期的長短直接影響細胞內(nèi)mRNA的積累量。其測定原理是利用放線菌素D（10ug／mL）可阻斷新的mRNA的轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄停止后的不同時間提取總RNA，通過Northem印跡雜交及掃描定量，確定阻斷前已轉(zhuǎn)錄的mRNA隨著時間遷移的衰減程度，以mRNA降解到原有mRNA的50％所需要的時間為該mRNA的半壽期。