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Cell總結(jié)CRISPR重要綜述與研究成果
閱讀：974 發(fā)布時(shí)間：2015-10-28作為新一代基因組編輯技術(shù)先鋒，CRISPR炙手可熱，這種zui初被微生物學(xué)家用以了解細(xì)菌免疫力的技術(shù)方法在過(guò)去的5年里，研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)而將CRISPR/Cas9發(fā)展為生物學(xué)研究的有力工具。CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，已經(jīng)加速了科學(xué)研究，并提高了研究人員產(chǎn)生遺傳模型的能力。 立即索取BioTek多功能酶標(biāo)儀的詳細(xì)資料 “Cell Press Selections"是由Cell出版社推出的一份推薦文章集合手冊(cè)，主要介紹某個(gè)生命科學(xué)研究領(lǐng)域的進(jìn)展及突出成果。相關(guān)特輯內(nèi)容包括研究論文，評(píng)論性文章以及snapshots，涉及了同一領(lǐng)域的方方面面，更為重要的是這些文章由贊助商贊助，可以免費(fèi)獲取。
作為新一代基因組編輯技術(shù)先鋒，CRISPR炙手可熱，這種zui初被微生物學(xué)家用以了解細(xì)菌免疫力的技術(shù)方法在過(guò)去的5年里，研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)而將CRISPR/Cas9發(fā)展為生物學(xué)研究的有力工具。CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，已經(jīng)加速了科學(xué)研究，并提高了研究人員產(chǎn)生遺傳模型的能力。
自2014年CRISPR技術(shù)應(yīng)用備受關(guān)注以來(lái)，目前已經(jīng)有超過(guò)1200篇相關(guān)的文章發(fā)布，許多實(shí)驗(yàn)室都在利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)分析各自的問(wèn)題，從小鼠到蚊子，CRISPR技術(shù)為基因組學(xué)研究領(lǐng)域帶來(lái)了一陣旋風(fēng)，取得了幾年前我們都不敢想象的成果。
在特輯：“CRISPR：The Next Generation"介紹了多篇綜述與研究報(bào)道，其中包括：
上篇： Cell特輯：CRISPR翻開(kāi)嶄新的一頁(yè)
Efficient Multiplexed Integration of Synergistic Alleles and Metabolic Pathways in Yeasts via CRISPR-Cas
來(lái)自美國(guó)Amyris Inc的研究人員，在酵母中實(shí)現(xiàn)了快速便捷的多點(diǎn)突變和大片段缺失構(gòu)建。與之前的復(fù)雜操作相比，這讓酵母中的基因供能研究變得更加快速和高通量化。生物通 www.ebiotrade。。ｃｏｍ
研究人員使用一種模塊化的gRNA傳遞策略，來(lái)實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變的多元整合，包括在三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)引入五個(gè)修改，以賦予菌株增強(qiáng)的耐醇性。
研究人員表明，一個(gè)單一線性化質(zhì)粒（攜帶多重PCR生產(chǎn)的引導(dǎo)RNA和供體DNA盒）的共轉(zhuǎn)化，可促進(jìn)點(diǎn)突變和大片段缺失構(gòu)建的集成。這種技術(shù)可讓研究人員以64%的效率，恢復(fù)無(wú)標(biāo)記的三重工程事件，而不需要選擇所有g(shù)RNA的表達(dá)。gRNA盒可以通過(guò)PCR很容易地產(chǎn)生，并在任何組合中傳遞。
Cell子刊：酵母中的基因組編輯
CRISPR-Cas9-Mediated Genetic Screening in Mice with Haploid Embryonic Stem Cells Carrying a Guide RNA Library
能代替精子細(xì)胞使用的單倍體細(xì)胞系的建立為獲取遺傳編輯的動(dòng)物模型提供了一種新的手段。然而，之前的研究顯示，半克隆小鼠的出生效率低（4.5%左右），而且約一半的半克隆小鼠出現(xiàn)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象。分析原因發(fā)現(xiàn)，原本在精子細(xì)胞中不表達(dá)的雄性印記基因H19在單倍體細(xì)胞和發(fā)育遲緩的半克隆小鼠中出現(xiàn)高表達(dá)的現(xiàn)象，這暗示印記基因的異常表達(dá)可能是導(dǎo)致半克隆小鼠胚胎發(fā)育異常的關(guān)鍵原因，通過(guò)調(diào)控印記基因的表達(dá)有可能提高半克隆小鼠的出生效率。
“類精子細(xì)胞"的單倍體細(xì)胞系的建立使得利用這一細(xì)胞快速制備遺傳編輯小鼠模型成為可能。為此，研究人員先后在H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細(xì)胞中進(jìn)行了多基因的敲除和敲入，建立了攜帶Tet1/Tet2/Tet3三基因敲除、P56/P63/P73三基因敲除以及Tet1-EGFP/Tet2-mCherry/Tet3-ECFP三基因敲入的細(xì)胞系，并證明這些細(xì)胞能穩(wěn)定支持半克隆小鼠的產(chǎn)生。
zui近，CRISPR-Cas9文庫(kù)被應(yīng)用到人和小鼠的細(xì)胞中進(jìn)行了全基因組水平的遺傳篩選。研究人員進(jìn)一步推測(cè)，如果H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細(xì)胞能夠攜帶CRISPR-Cas9文庫(kù)，讓單個(gè)的細(xì)胞攜帶一個(gè)sgRNA和Cas9核酸酶，通過(guò)注入卵子中則可以批量產(chǎn)生攜帶不同突變基因的半克隆小鼠，從而使得小鼠個(gè)體水平的遺傳篩選成為可能。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，研究人員驗(yàn)證了這一設(shè)想，從而*哺乳動(dòng)物在個(gè)體水平進(jìn)行遺傳篩選的空白，為遺傳發(fā)育研究提供了新的體系。
Genome Engineering with CRISPR-Cas9 in the Mosquito Aedes aegypti
美國(guó)洛克菲勒大學(xué)的研究人員利用基因編輯技術(shù)（CRISPR-Cas9），掌握了致命的“埃及伊蚊"如何傳播疾病，叮咬人類等信息，有望對(duì)其進(jìn)行技術(shù)干預(yù)。
研究人員發(fā)現(xiàn)在這種蚊子的幾個(gè)基因上，用CRISPR-Cas9技術(shù)有效產(chǎn)生靶向基因突變和干預(yù)效果。這個(gè)項(xiàng)目的近期目標(biāo)是了解埃及伊蚊作為疾病載體，其不同基因如何有效運(yùn)作并產(chǎn)生免疫系統(tǒng)。
Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis
研究人員利用Broad研究所的“小鼠全基因組CRISPR敲除文庫(kù)A" (mGeCKOa)(靶向小鼠基因組中所有基因的CRISPR向?qū)NA匯合文庫(kù))，以及Cas9 DNA切割酶處理了來(lái)自非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)小鼠模型的細(xì)胞。這一系統(tǒng)將突變導(dǎo)入到了一些特定基因中，破壞了它們的序列并阻止了這些基因生成蛋白。這一方法確保了在每個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)基因被敲除，在培養(yǎng)的異質(zhì)細(xì)胞群中則以小鼠基因組中的所有基因作為靶標(biāo)。研究人員隨后將這些細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)用這一基因敲除文庫(kù)處理的一些細(xì)胞形成了高轉(zhuǎn)移性腫瘤。
利用新一代測(cè)序，科學(xué)家們鑒別出了在原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶中敲除的基因，指出了一些基因有可能是通常抑制腫瘤生長(zhǎng)的腫瘤抑制基因，當(dāng)敲除它們時(shí)會(huì)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。
研究結(jié)果突出顯示了一些在人類腫瘤中*的腫瘤抑制基因，包括Pten、Cdkn2a和Nf2，也涵蓋了一些從前未與癌癥關(guān)聯(lián)的基因。出乎意料地是，這一篩查系統(tǒng)還揭示了幾個(gè)microRNAs。
張鋒博士Cell：讓CRISPR在癌癥領(lǐng)域大放異彩
A CRISPR/Cas9 Vector System for Tissue-Specific Gene Disruption in Zebrafish
CRISPR/Cas9技術(shù)作為基因編輯工具目前已在多個(gè)平臺(tái)和系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用，大大方便了在體內(nèi)和體外對(duì)靶向基因進(jìn)行敲除操作。在該研究中，研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR-Cas9技術(shù)的載體系統(tǒng)，在斑馬魚(yú)上實(shí)現(xiàn)了組織特異性基因敲除。他們?cè)诎唏R魚(yú)中，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在單細(xì)胞胚胎階段通過(guò)簡(jiǎn)單地注射導(dǎo)向RNA(gRNA)和Cas9 mRNA快速獲得基因敲除斑馬魚(yú)。為證明該項(xiàng)技術(shù)的可應(yīng)用性，研究人員構(gòu)建了攜帶gata1啟動(dòng)子的載體，驅(qū)動(dòng)Cas9表達(dá)，在紅細(xì)胞中特異性敲除了參與血紅素合成的urod基因。通過(guò)靶向Urod基因，研究人員在斑馬魚(yú)胚胎中觀察到攜帶紅色熒光的紅細(xì)胞，重復(fù)了在yquem突變的斑馬魚(yú)中觀察到的表型。雖然F0代胚胎中出現(xiàn)鑲嵌基因中斷，但在F1代斑馬魚(yú)中，這種表型非常明顯。
這套基于CRISPR的載體系統(tǒng)為在斑馬魚(yú)上實(shí)現(xiàn)組織特異性基因敲除提供了一種便捷的方法，大大拓寬了在斑馬魚(yú)中進(jìn)行功能缺失的研究范圍，具有重要意義。
Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening生物通 www.ebiotrade。。ｃｏｍ
研究人員在一期《發(fā)育細(xì)胞》（Developmental Cell）雜志上，詳細(xì)描述了稱作為CRISPR-EATING的過(guò)程。
在原理論證研究中，研究人員將常見(jiàn)腸道細(xì)菌——大腸桿菌的整個(gè)基因組變成了覆蓋88%細(xì)菌基因組的包含4萬(wàn)個(gè)向?qū)NAs的文庫(kù)。每個(gè)向?qū)NA都是一個(gè)長(zhǎng)20個(gè)RNA堿基對(duì)的片段：CRISPR-Cas9利用它作為模板來(lái)找出互補(bǔ)DNA結(jié)合并進(jìn)行切割。
這些文庫(kù)可用于傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9編輯中靶向基因組中任何特定的DNA序列并切割它，當(dāng)研究人員試圖闡明某一基因的功能時(shí)就會(huì)這樣做：即敲除這一基因，看看細(xì)胞中會(huì)發(fā)生什么不好的事情。這可以幫助確定疾病的原因。這一稱作為遺傳篩查的過(guò)程要分批來(lái)完成：將成千上萬(wàn)的探針各自導(dǎo)入培養(yǎng)板上數(shù)十萬(wàn)細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞中。