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前言

乳鐵蛋白，這一名字中的“蛋白”源自拉丁文“proteios”，寓意著它在自然界中的至關(guān)重要的地位。它是天然存在于哺乳動(dòng)物乳汁中的一種特殊蛋白質(zhì)。在人體內(nèi)，蛋白質(zhì)是構(gòu)建身體組織、調(diào)節(jié)生理功能的重要物質(zhì)，而乳鐵蛋白更是其中的佼佼者，作為一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，它的重要性不言而喻。

近年來(lái)，乳鐵蛋白應(yīng)用越來(lái)越廣泛，不僅是牛奶中的營(yíng)養(yǎng)寶藏，還因?yàn)槠鋸?qiáng)大的抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，在保健品、嬰幼兒配方奶粉及護(hù)膚品領(lǐng)域中嶄露頭角。然而，乳鐵蛋白對(duì)外部環(huán)境，尤其是溫度的變化非常敏感。一旦溫度過高，就極易破壞其穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其功能的正常發(fā)揮。

為了解決這一技術(shù)難題，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 4439-2023（2024.5.1實(shí)施），該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)介紹了一種高效液相色譜法用于奶及奶制品中乳鐵蛋白的測(cè)定。這一方法的實(shí)施，將有助于我們更準(zhǔn)確地檢測(cè)牛奶中未變性的乳鐵蛋白含量，從而為奶業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展提供有力支持。

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實(shí)驗(yàn)部分

色譜條件

賽里安LC6000超高效液相色譜

表1. 方法參數(shù)

試劑及標(biāo)準(zhǔn)品配置

乙腈（HPLC級(jí)）；三氟乙酸（HPLC級(jí)）；

牛乳鐵蛋白（編號(hào)：CDAA-200251）

①磷酸鹽緩沖液Ⅰ：稱取7.1 g磷酸氫二鈉、58.4 g氯化鈉，加900 mL水溶解，用磷酸調(diào)pH至8.0±0.2，加水定容至1000 mL，臨用現(xiàn)配。

②磷酸鹽緩沖液Ⅱ：稱取28.4 g磷酸氫二鈉，加800 mL水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5±0.2，再加入20 mL乳鐵蛋白結(jié)合液A，加水稀釋至1000 mL。

Tip：使用磷酸鹽緩沖液來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和稀釋待測(cè)樣品，提取其中乳鐵蛋白。這一步的原理是乳鐵蛋白在適當(dāng)?shù)膒H值和離子強(qiáng)度條件下具有良好的溶解性。而磷酸氫二鈉可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值和離子強(qiáng)度，有助于乳鐵蛋白從食品基質(zhì)（如牛乳、乳粉等）中溶解出來(lái)。在提取過程中，磷酸氫二鈉提供的緩沖環(huán)境能夠保護(hù)乳鐵蛋白不受酸堿變化的影響，從而保持其穩(wěn)定性和生物活性。提取后的離心操作，將溶解了乳鐵蛋白的緩沖液與食品基質(zhì)中的不溶物分離，以便后續(xù)純化和檢測(cè)。

結(jié)果

示例圖譜

乳鐵蛋白分離度好，出峰尖銳，詳見圖1。

圖1 乳鐵蛋白50mg/L示例色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線

將乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋為0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0mg/L使用外標(biāo)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)定量 ，以濃度為橫坐標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)作外標(biāo)工作曲線 ；乳鐵蛋白響應(yīng)值和濃度呈良好的線性關(guān)系，所得到的相關(guān)系數(shù)在0 .9990以上，詳見圖2。

圖2 乳鐵蛋白0-100mg/L重疊圖

重現(xiàn)性

乳鐵蛋白峰面積RSD%=1.66（n=6）保留時(shí)間RSD%=0.03（n=6）結(jié)果見表3。

圖3 乳鐵蛋白50mg/L重疊圖（n=6）

結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用賽里安LC6000 UHPLC系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)乳鐵蛋白的檢測(cè)，靈敏度、穩(wěn)定性、線性均滿足需求。

實(shí)驗(yàn)總結(jié)

①乳鐵蛋白結(jié)合液A放置時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，使用前搖勻即可。

②配制磷酸鹽緩沖液Ⅱ時(shí)，調(diào)pH前的溶液pH值應(yīng)在9.00以上，否則提取效率會(huì)降低。調(diào)完pH后加乳鐵蛋白結(jié)合液A然后定容，定容后混勻即可，不需要?jiǎng)×覕嚢瑁?/span>

③首次使用ChromCore 300 C4-T色譜柱時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)色譜峰型不對(duì)稱或響應(yīng)低的情況，此時(shí)需要使用高濃度牛乳鐵蛋白對(duì)照品（400 μg/mL進(jìn)樣100 μL）對(duì)色譜柱進(jìn)行鈍化處理，鈍化后將色譜柱沖洗至無(wú)牛乳鐵蛋白的目標(biāo)峰后，再進(jìn)行樣品分析；

④因?yàn)榈鞍自贑4分析柱上會(huì)有一定殘留，建議在做柱容量測(cè)試后，空針進(jìn)樣兩次把蛋白殘留降低后再進(jìn)行后續(xù)測(cè)試

⑤色譜柱使用結(jié)束后，需用純乙腈沖洗30 min對(duì)色譜柱進(jìn)行保存，保證下次色譜柱可以正常使用。

寫在最后

檢測(cè)乳鐵蛋白含量的實(shí)驗(yàn)并不復(fù)雜，但是也是食品安全防線中的一部分。除了乳鐵蛋白的檢測(cè)，賽里安還有多種產(chǎn)品和方案用于食品科學(xué)研究，這些產(chǎn)品方案在默默守護(hù)健康安全的餐桌的同時(shí)，也不斷助力食品科學(xué)的發(fā)展。

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[5] 食品中乳鐵蛋白的提取與檢測(cè)（第二代肝素親和柱+乳鐵蛋白結(jié)合液）

[6] 新標(biāo)準(zhǔn)今日實(shí)施！賽里安帶你全面解讀維生素D測(cè)定新方法！

[7] 熱點(diǎn)應(yīng)用丨賽里安LC6000-高效液相色譜法檢測(cè)原料乳及乳制品中的三聚氰胺 GB/T 22388-2008

[8] 熱點(diǎn)應(yīng)用丨賽里安LC6000 HPLC搭配DAD檢測(cè)器分析復(fù)雜基質(zhì)中的水溶性維生素