凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的空隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內擴散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流量增長，移動速率慢而后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫。這樣，經過層析柱，使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離。
對生物樣品來說，經常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質分開，如蛋白質與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。
1）類分離
目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質，并不要求分離分子量相近的組分。
2）分級分離
目的是分開分子量不是很懸殊的大分子物質。選擇凝膠型號時必須使各種物質的Kd(分離系數(shù))值盡可能相差大一些。
層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。
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