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關(guān)于WB實(shí)驗(yàn)中蛋白樣品制備的常見問題分析

閱讀:2233      發(fā)布時(shí)間:2021-6-3
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  WB實(shí)驗(yàn)又稱免疫印跡實(shí)驗(yàn),是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù),具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。
  
  對(duì)于一直都在做蛋白研究的你,在樣品制備中的小細(xì)節(jié)你都了解嗎?這里為大家整理了蛋白樣品制備中大大小小的常見問題,一起來學(xué)習(xí)吧!
  
  1、所有WB實(shí)驗(yàn)都用總蛋白就可以完成嗎?
  
  當(dāng)然不是,要根據(jù)WB的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定提取哪類蛋白,如需驗(yàn)證某些低豐度蛋白,或蛋白定位,或組分間表達(dá)量對(duì)比,則需要進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離或組分分離。
  
  2、如需添加蛋白酶抑制劑該如何添加?
  
  內(nèi)源性蛋白酶存在于胞漿中,所以要在細(xì)胞裂解前加入抑制劑到達(dá)理想的抑制效果,提取時(shí)將抑制劑添加到裂解液中,工作濃度1X。例如100X蛋白酶抑制劑,1ml裂解液中添加10ul即可。
  
  3、蛋白樣品如何儲(chǔ)存?
  
  A蛋白樣品不建議久存,也不要反復(fù)凍融。下游做WB實(shí)驗(yàn),建議蛋白濃度測(cè)定后,加入loadingbuffer煮樣,煮后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分裝成小管在-80℃,下次使用前拿出小管再次煮樣即可。
  
  4、樣品上樣前怎么處理?
  
  蛋白濃度測(cè)定后,建議將各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度(稀釋可以PBS,水或裂解液),加入loadingbuffer后,在沸水中煮3-5分鐘,使蛋白充分變性,也可使用PCR儀95度加熱5分鐘。
  
  5、組織樣品含血量多可以直接提蛋白嗎?
  
  如組織樣品中含血較多,血紅蛋白可能會(huì)影響WB實(shí)驗(yàn),可以在組織樣品裂解前使用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理后,再進(jìn)行蛋白提取。

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