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α-酮戊二酸脫氫酶活性測(cè)定試劑盒 三羧酸循

貨號(hào)：BC0710

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體0.6mL×1支，-20℃保存；

試劑三：液體55mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑八：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加入2mL雙蒸水充分混勻待用，用不完的試劑仍-20℃保存。

工作液的配制：臨用前把試劑四、試劑五、試劑六、試劑七轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解待用。

產(chǎn)品說明：

    α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動(dòng)物、植物微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。

    α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀器和用品：

    紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、α-KGDH的提取

     稱取約0.1g組織或收集約500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑二，冰浴用勻漿器或研缽充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零

2. 空白管：

取1mL工作液加入1mL石英比色皿，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL試劑八和60μL蒸餾水，混勻并立即測(cè)量340nm處0s的吸光值A(chǔ)1，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)2min，記錄340nm處2min時(shí)的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA空白=A2-A1。

3.測(cè)定管：

取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL試劑八和60μL樣本，混勻并立即測(cè)量340nm處0s的吸光值A(chǔ)3，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確反應(yīng)2min，記錄340nm處2min時(shí)的吸光值A(chǔ)4，計(jì)算ΔA測(cè)定=A4-A3。

三、α-KGDH活性計(jì)算

1.按樣本蛋白濃度計(jì)算

     單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

     α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=1473.7×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr

2.按樣本鮮重計(jì)算

     單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

     α-KGDH（U/g 鮮重）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1488.5×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W

3. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

    單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

    α-KGDH活性（U/10⁴cell）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)  ÷T=2.977×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)

    V反總：反應(yīng)體系總體積，1.1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.06mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

注意事項(xiàng)：

1、測(cè)定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4、測(cè)定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測(cè)定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進(jìn)行稀釋。

α-酮戊二酸脫氫酶活性測(cè)定試劑盒 三羧酸循