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GB4789.3-2016 大腸菌群計(jì)數(shù)及注意事項(xiàng)

時(shí)間:2024/4/17閱讀:1539
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大腸菌群定義和衛(wèi)生學(xué)意義


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大腸菌群定義:

在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名,它不代表某一種或某一屬的細(xì)菌,而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括:埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬(又叫產(chǎn)氣桿菌屬,包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌)和等。

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衛(wèi)生學(xué)意義:

大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評價(jià)樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性。直接反映了樣品受糞便污染的程度。

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02

GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法

1


什么是MPN法?

MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的zui低稀釋度與生長的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。

MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù),實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn),MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點(diǎn)。

靈敏度較高,適用于污染菌落較少的樣品。

2


大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)操作

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操  作  注  意  事  項(xiàng)

1

建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液,因?yàn)榱姿猁}緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化,對細(xì)菌具有保護(hù)作用。

2

初發(fā)酵接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯。

3

培養(yǎng)基檢查。加入樣品前應(yīng)觀察導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡,若有,應(yīng)適當(dāng)傾斜試管,讓氣體排出。

4

結(jié)果觀察。某些食品樣品可能會堵塞小導(dǎo)管底部,影響導(dǎo)管內(nèi)氣泡的觀察,可將試管微微傾斜,用手指輕彈管壁,觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起,若有,則判定產(chǎn)氣。


3


培養(yǎng)基原理解析

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)

? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長,胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。

? 36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣,則可停止培養(yǎng)。如果沒有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象,則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。

? 如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯。

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煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)

? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。

? 培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽,大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會與膽鹽發(fā)生反應(yīng),形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色。

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4


大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)報(bào)告

確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù),檢索MPN表,報(bào)告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值

當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時(shí),如:陽性管數(shù)為122,123,232,233等時(shí),建議增加稀釋度(可做4~5個(gè)稀釋度),使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(diǎn)(如果污染程度不能判定,則多加一稀釋度),然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找,最終確定MPN值。

表B.1

大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表

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03

GB4789.3-2016大腸菌群計(jì)數(shù)平板法

1


大腸菌群平板計(jì)數(shù)法流程圖

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操  作  注  意  事  項(xiàng)

1

平板法相對MPN法來說,結(jié)果更加直觀精確。長成的一個(gè)單菌落也可能來自樣品中的2~3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。適用于污染較為嚴(yán)重的樣品。

2

從一個(gè)樣品取樣到傾注瓊脂平板,應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成。

3

檢驗(yàn)所用物品應(yīng)無菌,無抑菌殘留物。

4

BGLB確證試驗(yàn)需從VRBA平板上挑起至少10個(gè)典型和可疑菌落進(jìn)行,如平板上菌落數(shù)少于10個(gè),則挑取全部典型和可疑菌落進(jìn)行確證。


2


培養(yǎng)基原理解析

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)

? 配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌,中性紅作為指示劑,在酸性條件下為紫紅色。

? 大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合,可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。

? 該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌,現(xiàn)配現(xiàn)用。

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3


計(jì)數(shù)典型和可疑菌落數(shù)

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大腸菌群定義:

選取菌落數(shù)在15CFU~150 CFU之間的平板,分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm或更大。

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證實(shí)試驗(yàn):

從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內(nèi),36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣,即可報(bào)告為大腸菌群陽性。

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大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告

經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管,證實(shí)有6個(gè)陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:

100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。

若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計(jì)算。

04

質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室過程中,每批樣品稀釋液都要做空白對照。

為了控制環(huán)境污染,每次檢驗(yàn)過程中,于檢驗(yàn)臺上打開兩塊計(jì)數(shù)瓊脂平板,并在檢驗(yàn)環(huán)境中暴露不少于15分鐘,將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng),以掌握檢驗(yàn)過程中是否存在來自檢驗(yàn)環(huán)境的污染。

定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品,在P2實(shí)驗(yàn)室或陽性對照實(shí)驗(yàn)室內(nèi),用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并進(jìn)行記錄,次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。

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05

大腸菌群測試片法

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原理

大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐,其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層(營養(yǎng)物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑)和透明隔水膜組成,經(jīng)輻照滅菌??捎糜谑称?、飲料等的大腸菌群計(jì)數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。

2


培養(yǎng)基原理解析

菌落計(jì)數(shù)特別方便(容易判讀),紅色菌落,易于食品顆粒分開,無菌落重疊現(xiàn)象;

菌落分布特別均勻;

避免了培養(yǎng)基對細(xì)菌熱損傷有關(guān);

菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生;

經(jīng)濟(jì)環(huán)保無粉塵,體積小,重量輕,易儲運(yùn);

保質(zhì)期長干制無水培養(yǎng)基,性質(zhì)穩(wěn)定,保質(zhì)期更長。

3


使用說明

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06

所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株

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