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高效液相色譜柱的正確使用

閱讀:419      發(fā)布時(shí)間:2023-9-20
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1.加裝保護(hù)柱
 
保護(hù)柱的作用是過濾掉來自流動(dòng)相和樣品的化學(xué)“拉圾”同時(shí)也可以有效除去流動(dòng)相和樣品中的不溶物。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動(dòng)相吸入口、進(jìn)樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學(xué)污然,因此,加裝保護(hù)柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復(fù)雜混合物和生物樣品時(shí)更是保護(hù)分析柱不可少的措施。
 
保護(hù)柱填料應(yīng)與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護(hù)柱屬消耗品,經(jīng)過一定次數(shù)的樣品分析(50~100次)后,出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時(shí),應(yīng)考慮更換保護(hù)柱。
 
2.過濾流動(dòng)相和樣品
 
流動(dòng)相通常由水或緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合而成,原則上,所有經(jīng)過色譜柱的流動(dòng)相均應(yīng)過濾,但在實(shí)際操作上應(yīng)視具體情況而有所區(qū)別:當(dāng)有機(jī)溶劑用色譜純級(jí),水用石英亞沸水或其它超純水時(shí),在能確保水和有機(jī)溶劑的質(zhì)量且沒有受到污染時(shí),過濾并無更多實(shí)際意義。
 
當(dāng)流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí),則過濾是必要的,如前所述,當(dāng)緩沖溶液放置一段時(shí)間(視環(huán)境溫度不同而異,夏季一般不超過48h,冬季一般不超過一周)后,在使用前還應(yīng)重新過濾。
 
所配制的樣品試液在注入流路系統(tǒng)前均要經(jīng)0.45μm(0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區(qū)分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染。裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用。
 
3.凈化樣品
 
當(dāng)樣品中含有對(duì)色譜柱有損害的化學(xué)成分,如產(chǎn)生永久性吸附的蛋白質(zhì)、糖等有機(jī)分子和強(qiáng)吸附性物質(zhì),以及可能對(duì)柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團(tuán)離子。在進(jìn)樣前應(yīng)盡可能對(duì)樣品進(jìn)行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分。
 
4.避免過高的柱壓
 
雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達(dá)6000psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會(huì)縮短色譜柱的壽命,避免的方法是:
 
(1)柱壓過高時(shí),盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。
 
(2)當(dāng)流速較大時(shí),應(yīng)采取流速梯度的辦法使流速分步到位。
 
(3)使用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí),進(jìn)樣閥的切換要盡可能的快。否則
 
超過20%的壓力沖擊會(huì)很快使柱報(bào)廢。當(dāng)使用多柱聯(lián)用時(shí),柱切換要避免在高壓下進(jìn)行。
 
5.注意溫度和酸堿度
 
一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱最高使用溫度不超過60℃,以低于40℃為宜,特別是在流動(dòng)相pH接近使用限度時(shí),更應(yīng)降低使用溫度。溫度過高會(huì)加快鍵合相的水解和硅膠的溶解,從而,使填料性質(zhì)改變,柱床塌陷,降低柱效,改變峰形。目前的鍵合硅膠色譜柱標(biāo)示的pH適用范圍可達(dá)2~10,但在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)避免極端的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在極端的pH條件下使用時(shí),可通過以下方法避免柱損害:
 
(1)在泵和進(jìn)樣閥之間加裝預(yù)柱(飽和柱)來飽和流動(dòng)相;
 
(2)降低使用溫度;
 
(3)檢驗(yàn)完畢后立即用與所使用的流動(dòng)相互相混溶的“溫和溶劑”徹底清洗。
 
6.正確及時(shí)的沖洗
 
開始試驗(yàn)前,應(yīng)了解柱中當(dāng)前是何種溶劑。對(duì)于新色譜柱,如無特殊說明均為評(píng)價(jià)報(bào)告中所用流動(dòng)相。柱中當(dāng)前溶劑一定要與分析樣品所用流動(dòng)相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。異丙醇是能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動(dòng)相使用。反相鍵合硅膠柱適宜的保存環(huán)境是純甲醇,如分析用流動(dòng)相為緩沖液2有機(jī)溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來的純甲醇,再進(jìn)分析用流動(dòng)相,以防止在柱內(nèi)發(fā)生鹽的沉淀;
 
試驗(yàn)結(jié)束后,要及時(shí)用適當(dāng)?shù)娜軇_洗系統(tǒng)并最終過渡到純甲醇沖洗,對(duì)于含有緩沖鹽的流動(dòng)相,最好的辦法是先用與分析用流動(dòng)相組成相同但不含緩沖鹽的溶液進(jìn)行沖洗,再逐步過渡到純甲醇沖洗。多數(shù)報(bào)道沖洗液體積大約為柱容積的15~20倍,但最終要以基線是否平直、壓力是否穩(wěn)定決定。有些廠家的色譜柱標(biāo)明了流動(dòng)相中有機(jī)相的最低使用濃度為≥5%,使用時(shí)應(yīng)給予注意。

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